化學發(fā)光分析法

1、化學發(fā)光分析法第1頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一基本原理常用的化學發(fā)光物質(zhì)儀器裝置影響化學發(fā)光的因素定性定量分析第2頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一化學發(fā)光（chemiluminescence）：又稱為冷光，它是在沒有任何光、熱或電場等激發(fā)的情況下由化學反應(yīng)而產(chǎn)生的光輻射。由于不需要外源性激發(fā)光源，避免了背景光和雜散光的干擾，降低了噪聲，大大提高了信噪比。具有靈敏度高，線性范圍寬，設(shè)備簡單，操作方便，易于實現(xiàn)自動化，分析快等特點。在生物工程學，藥物學，分子生物學，臨床和環(huán)境化學等各個領(lǐng)域正顯示出它蓬勃的生機。第3頁，共50頁，2022年，5月2

2、0日，23點0分，星期一一、基本原理化學發(fā)光反應(yīng)：顧名思義，伴隨著光輻射發(fā)生的化學反應(yīng)，成為化學發(fā)光反應(yīng)?；瘜W發(fā)光劑：在不同的化學反應(yīng)中，可以和多種不同的組分反應(yīng)并發(fā)生能量交換，生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物并產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象的試劑常被成為化學發(fā)光劑。它們可以是氧化劑、還原劑、某些能生成自由基的物質(zhì)。第4頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一化學發(fā)光反應(yīng)機制 在化學反應(yīng)過程中，某些反應(yīng)產(chǎn)物由于吸收了反應(yīng)產(chǎn)生的化學能，由基態(tài)躍遷至較高電子激發(fā)態(tài)中各個不同能級，然后經(jīng)過振動弛豫或內(nèi)轉(zhuǎn)換到達第一電子激發(fā)態(tài)的最低能級，由此以輻射的形式放出能量躍回到基態(tài)。在個別情況下，它可以通過系間躍遷到達亞穩(wěn)的三重態(tài)，

3、然后再回到基態(tài)的各個振動能級，并產(chǎn)生光輻射，這兩種光都是化學發(fā)光。 A +B = C + D*（激發(fā)態(tài)分子） D* D + h（激發(fā)態(tài)分子D* 的光輻射）第5頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一化學發(fā)光反應(yīng)的條件能快速地釋放出足夠的能量。能產(chǎn)生化學發(fā)光的物質(zhì)大多為有機化合物，芳香族化合物；化學發(fā)光反應(yīng)多為氧化還原反應(yīng)，激發(fā)能與反應(yīng)能相當 ，E=170300 kJ/mol；發(fā)光位于可見光區(qū)；處于激發(fā)狀態(tài)的分子或原子必須能夠放出光子，或者能夠轉(zhuǎn)移它的能量到另一個分子上而使此分子被激發(fā)。第6頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一2.化學發(fā)光效率和發(fā)光強度化學發(fā)光

4、效率：化學效率：發(fā)光效率： 化學效率主要取決于發(fā)光所依賴的化學反應(yīng)本身；而發(fā)光效率則取決于發(fā)光體本身的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，也受環(huán)境的影響。第7頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一發(fā)光強度 化學發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光強度Icl是以單位時間內(nèi)發(fā)射的光子數(shù)表示，它與化學發(fā)光反應(yīng)的速率有關(guān)。 時刻t 的化學發(fā)光強度(單位時間發(fā)射的光量子數(shù))： 如果反應(yīng)是一級動力學反應(yīng)，t時刻的化學發(fā)光強度Icl與該時刻的分析物濃度c成正比，即化學發(fā)光峰值強度與分析物濃度c成線性關(guān)系。在化學發(fā)光分析中，常用已知時間內(nèi)的發(fā)光總強度來進行定量分析。第8頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一二、常見的化

5、學發(fā)光劑和化學發(fā)光體系魯米諾過氧化草酸酯酸性高錳酸鉀四價鈰吖啶酯化合物第9頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一魯米諾早在1853年就被合成出來了。1928年，化學家首次發(fā)現(xiàn)這種化合物有一個奇妙的特性，它被氧化時能發(fā)出藍光。刑偵學應(yīng)用 在檢驗血痕時，魯米諾與血紅素（hemoglobin，血紅蛋白中負責運輸氧的一種蛋白質(zhì)）發(fā)生反應(yīng)，顯出藍綠色的熒光。這種檢測方法極為靈敏，能檢測只有百萬分之一含量的血。簡介第10頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一魯米諾(luminol)（又名發(fā)光氨）化學名稱為3-氨基鄰苯二甲酰肼。常溫下是一種黃色晶體或者米黃色粉末，是一種比

6、較穩(wěn)定的人工合成的有機化合物化學式為C8H7N3O2溶液顯強酸性，對眼睛、皮膚、呼吸道有一定刺激作用。第11頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一魯米諾發(fā)光原理第12頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一合成3-硝基鄰苯二甲酸 + 肼H2O + 3-硝基鄰苯二甲酰肼 保險粉(強還原劑）3-氨基鄰苯二甲酰肼(魯米諾) 高沸點溶劑（如二甘醇）縮合反應(yīng) 還原第13頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一發(fā)光體系魯米諾-H2O2體系魯米諾-KIO4體系第14頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一魯米諾-H2O2的反應(yīng)是自身化學發(fā)光反

7、應(yīng)在PH=11的水溶液中發(fā)光效率最大魯米諾與氫氧化物反應(yīng)時生成了一個雙負離子（Dianion），它可被過氧化氫分解出的氧氣氧化，產(chǎn)物為一個有機過氧化物。該過氧化物很不穩(wěn)定，立即分解出氮氣，生成激發(fā)態(tài)的3-氨基鄰苯二甲酸。激發(fā)態(tài)至基態(tài)轉(zhuǎn)化中，釋放的能量以光子的形式存在，波長位于可見光的藍光部分第15頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一應(yīng)用直接作用：增敏和抑制作用 過渡金屬：Cu2+,Cr3+,Ni2+,Co2+,Fe2+ 維生素B6，維生素B12，維生素C，嗎啡，可待因，腎上腺素，多巴胺，細胞色素間接作用 如 Fe2+對魯米諾-H2O2體系有催化增敏作用，而蛋白質(zhì)卻抑制此作用

8、，據(jù)此可建立檢測血清中蛋白質(zhì)含量的方法。酶 在體系中加入辣根過氧化物酶等，利用其對底物的酶解并生成H2O2的反應(yīng)，可測定酶含量、底物含量或H2O2含量。第16頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一魯米諾-KIO4體系催化作用 如Co2+,Mn2+,維生素C 1)利用該體系可測定樣品中這些組分 2)利用Mn2+對該體系的催化作用來測定水中的IO4-在PH=1213的水溶液中，體系發(fā)光效率最大第17頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一在免疫分析中的應(yīng)用將發(fā)光物質(zhì)(在反應(yīng)劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體) 直接標記在抗原或抗體上免疫反應(yīng)復合物上的酶作用于發(fā)光底物 目前常

9、用的標記酶為辣根過氧化物酶(HRP)第18頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（HRP）標記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測標本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶（HRP）標記抗體復合物，這時加入魯米諾發(fā)光劑、H2O2和化學發(fā)光增強劑使產(chǎn)生化學發(fā)光。 辣根過氧化物酶標記的化學發(fā)光免疫分析第19頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一 過氧化草酸酯（鹽）自身并不發(fā)光，氣化學發(fā)光均為敏華化學發(fā)光。原理：芳香草酸酯的過氧化氫的氧化作用，芳香草酸鹽和H2O2反應(yīng)形成過氧草酰中間體，當該中間體與蒽類衍生物等熒光劑接

10、觸時，會發(fā)出強烈的所加熒光劑特有的熒光。簡介第20頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一第21頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一第22頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一過氧化草酸酯的化學發(fā)光反應(yīng)體系（1）草酸酯-過氧化氫-蒽類衍生物體系：迄今發(fā)現(xiàn)的效率最高的非生物化學發(fā)光反應(yīng)體系。由于蒽類衍生物的脂溶性較強，所以反應(yīng)體系的溶液中通常會加入一定量的有機溶劑或表面活性劑。 蒽的衍生物:9 ,102二苯基蒽,9 ,102二苯乙炔基蒽 5 ,6 及其取代衍生物79 等。除此之外,還有萘10 和聚酰亞胺11 ,12 的取代衍生物。第23頁，共

11、50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一（2）草酸酯-H2O2體系：主要用于測定那些酶反應(yīng)產(chǎn)物為H2O2的酶底物，如葡萄糖、氨基酸等。 改變H2O2用量，對體系發(fā)光強度影響不大，由于H2O2具有易分解性質(zhì)，一般H2O2用量為草酸酯34倍。第24頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一（3）草酸酯-過氧化氫-熒光待測物體系：用于測定某些具有熒光或其衍生物具有熒光的組分進行分析測定，如環(huán)孢素A、兒茶酚胺、類固醇、地塞米松等。第25頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一酸性高錳酸鉀 具有很強的氧化能力，可以與多種無機物和有機物進行氧化還原反應(yīng)，但由于其反應(yīng)

12、的發(fā)光強度較弱，所以知道20世紀70年代以后，伴隨著微弱光檢測技術(shù)的發(fā)展才得到廣泛的研究和應(yīng)用。第26頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一酸性高錳酸鉀體系（1）高錳酸鉀-待測物體系 酸性介質(zhì)中，該體系可直接測定二氧化硫、丁丙諾非、對氨基苯甲酸酯類麻醉劑、腎上腺素、維生素C、5-羥色胺、可待因等組分。（2）高錳酸鉀-甲醛-待測物體系 可以對甲胺嘌呤、雙氯芬酸、氨基比林、L-色氨酸、碘、酪氨酸等組分進行檢測。（3）高錳酸鉀-連二亞硫酸鈉-待測物體系 可測定維生素B6、利血平、胡延索乙素、核黃酸等組分。第27頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一四價鈰 可直接與

13、多種還原性無機物或者有機物放生氧化還原反應(yīng)，是強氧化性化學發(fā)光劑之一。發(fā)光體系雖然簡單，但由于不收Cl-的影響，更合適水樣中有機物污染的檢測。第28頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一四價鈰體系（1）鈰-待測物體系 可用于檢測對乙酰氨基酚、色氨酸。（2）鈰-聯(lián)苯三酚-氧體系 可檢測環(huán)境水樣中的溶解氧。（3）Ce4+-SO32-體系 利用某鞋熒光性有機物對其的增敏作用，可以測定奎寧、奎寧丁、辛可丁、膽汁酸和多種皮質(zhì)類固醇、甾族化合物。（4）Ce4+-RhB（羅丹明B）-還原性待測物體系 用于測定葉酸、巰嘌呤、維生素C（鹽）和噻唑類席夫堿。（5）Ce4+-Ru（phen）32+

14、（二價釕-鄰菲啰啉配合物）體系 可用于草酸、丙酮酸、維生素C、枸櫞酸、酒石酸、戊二醛和部分氟代喹諾酮衍生物的測定。第29頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一吖啶酯化合物：該化合物是應(yīng)用最廣泛的化學發(fā)光劑之一。代表性物質(zhì)為光澤精，在堿性介質(zhì)中，光澤精-H2O2金屬離子、還原性化合物以及產(chǎn)生H2O2基質(zhì)或酶的測定。第30頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一三 儀器裝置第31頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一第32頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一 裝置流程：發(fā)光反應(yīng)室光檢測器信號放大器顯示與記錄 發(fā)光反應(yīng)可采用靜態(tài)

15、或流動注射的方式進行： 靜態(tài)方式：用注射器分別將試劑加入到反應(yīng)器中混合， 測最大光強度或總發(fā)光強度；試樣量小，重復性差； 流動注射方式：用蠕動泵分別將試劑連續(xù)送入混合器，定時通過測量室，連續(xù)發(fā)光，測定最大光強度；試樣量大；第33頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一化學發(fā)光儀第34頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一LUM-F流動注射化學發(fā)光儀器第35頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一第36頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一四、影響化學發(fā)光的因素化學發(fā)光體系的選擇PH反應(yīng)體系中各試劑的濃度樣品溶液中的共存組分 化

16、學發(fā)光的強度（光量子數(shù)）決定于化學發(fā)光反應(yīng)的各個過程，所以組成化學發(fā)光反應(yīng)體系的各個因素都將影響待測物的測定。第37頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一（一）化學發(fā)光體系的選擇化學發(fā)光體系主要包括化學發(fā)光劑，與化學發(fā)光劑反應(yīng)的試劑、催化劑、增敏劑、緩沖劑、溶劑等。第38頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一依據(jù)待測組分的性質(zhì)，選擇相適應(yīng)的化學發(fā)光體系 化學發(fā)光反應(yīng)多為氧化還原反應(yīng)(1) 如果待測組分能直接與強氧化劑反應(yīng)，可選擇強化氧化性化學發(fā)光劑-待測物體系，如：KMnO4 -待測物、KIO4-待測物、Ce4+-待測物等。 第39頁，共50頁，2022年，

17、5月20日，23點0分，星期一依據(jù)待測組分的性質(zhì)，選擇相適應(yīng)的化學發(fā)光體系 化學發(fā)光反應(yīng)多為氧化還原反應(yīng)(2) 如果待測物能夠直接與H2O2反應(yīng)或其參與的酶促反應(yīng)改變了H2O2的含量，可選擇魯米諾- H2O2體系、草酸酯-過氧化氫-蒽類衍生物體系，或者光澤精- H2O2體系。第40頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一如果是建立新的發(fā)光體系，則以簡單、高效為原則。首先考慮化學發(fā)光劑-待測物體系，確定測量波長。然后對體系的溶劑、緩沖劑進行篩選，最后再篩選催化劑和增敏劑。第41頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一（二）PH不同的反應(yīng)體系需要不同的PH條件，其最

18、佳值可通過發(fā)光強度-pH的關(guān)系曲線確定。通過實驗可以最終確定緩沖體系的組成，使體系的化學發(fā)光的強度相對較大。第42頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一（三）反應(yīng)體系中各試劑的濃度除待測物以外，反應(yīng)體系中所有試劑都要通過發(fā)光強度濃度的關(guān)系曲線找出最佳使用濃度范圍，并最終確定各試劑的濃度。第43頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一（四）樣品溶液中的共存組分干擾組分對發(fā)光的影響可以是增敏的效果，也可以是猝滅的作用。通過干擾實驗來檢查和測定樣品溶液中可能存在的，對化學發(fā)光有影響的干擾組分，尋找其消除方法。第44頁，共50頁，2022年，5月20日，23點0分，星期一五、定性定量分析 化學發(fā)光法是一種簡便、快速、靈敏的痕量分析方法。在一定的條件下，化學發(fā)光體系的發(fā)光強度（或光量子數(shù)）與待測組分的濃度成正比。 對于成分簡單的樣品，eg:西藥，通過標準曲線法、標準加入法等可直接對待測組分進行很