代謝組學及其技術(shù)規(guī)范

1、代謝組學及其技術(shù)規(guī)范指導教師: 教 授 副 教 授 學 生： 專 業(yè)：本草生物學.7.20第1頁代謝組學PART 1總結(jié)展望PART 3目錄 CONTENT技術(shù)規(guī)范PART 2研究內(nèi)容PART 42/45第2頁 1 代謝組學1.1 概述 1.2 代謝組學分析技術(shù)1.3 代謝組學數(shù)據(jù)分析與處理1.4 代謝組學與中醫(yī)藥1.5 代謝組學應用3/45第3頁關(guān)鍵思想：利用當代分析技術(shù)定量地測定生物體在不一樣狀態(tài)下（生理病理狀態(tài)、藥品干預前后等）參加物質(zhì)傳遞、能量代謝和信息傳導等代謝調(diào)控小分子代謝物質(zhì)即代謝物組改變，并利用模式識別將這種應答與體內(nèi)生物學事件相關(guān)聯(lián)，定位事件發(fā)生靶器官，從而確定生物標識物，表

2、征或揭示生物體在特定時間、環(huán)境下整體功效狀態(tài)。1.1 概述 代謝組學是繼基因組學，蛋白質(zhì)組學之后，從整體角度，經(jīng)過碩士物體、器官或組織內(nèi)源性代謝物質(zhì)代謝路徑及其所受內(nèi)在環(huán)境原因影響及隨時間改變規(guī)律一門新興學科。研究對象代謝物靶標分析：某一類結(jié)構(gòu)性質(zhì)相關(guān)化合物。代謝物指紋分析：同時對多個代謝物進行分析，不分離判定詳細 單一 組分。代謝物輪廓分析：限定條件下對生物體內(nèi)特定組織內(nèi)代謝產(chǎn)物 快速定性和半定量分析。代謝組分析：對生物體或體內(nèi)某一特定組織所包含全部代謝物 定量分析并研究該代謝物組在外界干預或病理生 理條件下動態(tài)改變規(guī)律。4/45第4頁代謝組學研究現(xiàn)實狀況 代謝組學自從出現(xiàn)以來，引發(fā)了各國科

3、學家極大興趣，短短來取得了突飛猛進發(fā)展，相關(guān)科研論文發(fā)表數(shù)量從1999年1篇到現(xiàn)在每年1200多篇是數(shù)量增加，主要發(fā)表在JPR,、JCB,、PLoS ONE、JPBA等雜志上，權(quán)威科學雜志Nature迄今已經(jīng)有3篇代謝組學相關(guān)文章發(fā)表。國內(nèi)CNKI也從幾篇綜述開始到現(xiàn)在已經(jīng)有上千篇出版，并已經(jīng)有相關(guān)書籍出版。中科院大連化物所（許國旺）中科院武漢物理數(shù)學研究所（唐慧儒）中南大學（梁逸曾）清華大學（羅國安）上海交通大學（賈偉）等帝國理工大學（Jereny K. Nicholson)萊頓大學（Van der Greef )美國加州大學Davis 分校普渡大學杜克大學 等。國外國內(nèi)5/45第5頁NMR

4、GC-MSLC-MS檢測動態(tài)范圍寬快速、無損靈敏度低1.2 代謝組學分析技術(shù) 檢測動態(tài)范圍寬靈敏度高利于快速定量分析靈敏度高用于揮發(fā)性物質(zhì)檢測檢測動態(tài)范圍窄6/45第6頁1.3 代謝組學數(shù)據(jù)分析與處理 樣本采集化合物種類多樣化 濃度動態(tài)范圍大 理化性質(zhì)復雜化儀器穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性、靈敏度代謝物分析全方面性譜峰校準、歸一化、重合、數(shù)據(jù)標準化代謝輪廓空間距離判別樣本分析多元統(tǒng)計分析代謝物判定生物學意義闡釋已知及未知代謝物判定代謝物去卷積同分異構(gòu)體識別代謝通路分析樣本制備圖 1 基于GC-MS尿液代謝組學研究沙棘籽油抗抑郁作用7/45第7頁圖 2 人體血漿1H NMR譜圖 譜圖采集圖3 人體血漿

5、樣本GC-MS總離子色譜圖（TIC） 圖4 正離子模式下各組人體血漿代謝物LC-MS總離子流圖圖5 負離子模式下各組人體血漿代謝物LC-MS總離子流圖8/45第8頁 多元統(tǒng)計分析是從經(jīng)典統(tǒng)計學中發(fā)展起來一個分支，是一個綜合分析方法，它能夠在多個對象和多個指標相互關(guān)聯(lián)情況下分析它們統(tǒng)計規(guī)律。主要內(nèi)容包含多元正態(tài)分布及其抽樣分布、多元正態(tài)總體均值向量和協(xié)方差陣假設檢驗、多元方差分析、直線回歸與相關(guān)、多元線性回歸與相關(guān)()和()、主成份分析與因子分析、判別分析與聚類分析、Shannon信息量及其應用。多元統(tǒng)計分析9/45第9頁多元統(tǒng)計分析主成份分析（PCA）偏最小二乘-判別分析（PLS-DA）正交偏

6、最小二乘-判別分析（OPLS-DA） 能夠在不具備樣品任何分組信息情況下對數(shù)據(jù)進行降維處理，使得樣本代謝表型內(nèi)在關(guān)系變得可視化。 在明確樣品分類信息前提下，尋找已知組別間變量差異或變量之間相關(guān)關(guān)系，找出樣品分離最大差異，從而最大程度地反應分類組別之間差異。 在PLS-DA基礎上，去除噪音信息，最大化程度地提取與試驗相關(guān)改變來尋找兩組之間差異代謝物。聚類分析SIMICA-PMATLAB10/45第10頁代謝物判定NMR經(jīng)驗解譜（一維和二維核磁譜圖結(jié)合）HMDB數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有文件GC-MS標品對照NIST數(shù)據(jù)庫HMDB數(shù)據(jù)庫LC-MS標品對照HMDB、 Mass Bank 、C-Clound數(shù)據(jù)庫已發(fā)

7、表文件.11/45第11頁生物意義闡述KEGG HMDB已經(jīng)有文件12/45第12頁圖6 差異代謝物含量熱點圖（Class 1, 健康對照下；Class 2，抑郁癥組，Class 3逍遙散組，色帶-4-4 代表代謝物含量由高到低）相關(guān)分析13/45第13頁ROC曲線分析ROC曲線用于臨床診療： ROC曲線下面積值在1.0和0.5之間。在AUC0.5情況下，AUC越靠近于1，說明診療效果越好。AUC在 0.5-0.7時有較低準確性，AUC在0.70.9時有一定準確性，AUC在0.9以上時有較高準確性。AUC=0.5時，說明診療方法完全不起作用，無診療價值。AUC30% 樣本搜集 在4凝結(jié) 1,

8、6, 24 h 17.65% 在25凝結(jié) I, 6, 24 h 44.8% 抗凝劑 肝素鈉 vs. EDTAvs.檸檬酸鈉 66% 樣本處理 離心時間 I5 min vs. 30min 8.3% 樣本儲存 血清儲存于4 6, 12, 24, 48 h 7.1% 血清儲存于25 6, 12, 24, 48 h 10% 血漿儲存于4 6, 12, 24, 48 h 7.1% 血漿儲存于25 6, 12, 24, 48 h 10% 血清儲存于-80 1, 3, 6個月 3% 冷凍/解凍循環(huán) 1, 5, 10次 2.9% 分裝20/45第20頁 提取溶劑系統(tǒng)：甲醇/氯仿/水 萃取次數(shù)：一步萃??；兩步萃

9、取生物組織 前處理方法優(yōu)化One stepTwo step極性部分非極性部位2.2 樣本前處理方法 21/45第21頁2.3 數(shù)據(jù)處理 1.導入原始的連續(xù)數(shù)據(jù)集2.峰對齊，糾正不同分析運行間的保留時間偏移3.色譜峰歸一化，以便在不同樣品運行間進行比較4.色譜峰檢測(峰選擇)5.離子去卷積，按化合物將離子分組6.利用已有的定制數(shù)據(jù)庫進行化合物鑒定7.執(zhí)行數(shù)據(jù)分析22/45第22頁數(shù)據(jù)處理軟件：無償軟件：XCMS、MetAlign和 MZmine 等商品化軟件：Water Markerlynx、 Trans Omics、Mass Hunter 和Chroma TOF等自主開發(fā)設計軟件（基于Matl

10、ab或R語言）： MetSign (Anal Chem. Oct 15;83(20):7668-75.)2.3 數(shù)據(jù)處理 23/45第23頁2.3 數(shù)據(jù)處理 RAW文件CDF文件csv文件R軟件excel文件SIMCA-P GC-MS NMR 代謝組學，采取MestReNova軟件進行此部分數(shù)據(jù)處理LC-MS代謝組學，普通有工作站自帶網(wǎng)站進行處理24/45第24頁2.4 代謝物判定 NMR經(jīng)驗解譜（一維和二維核磁譜圖結(jié)合）HMDB數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有文件GC-MS標品對照NIST數(shù)據(jù)庫HMDB數(shù)據(jù)庫LC-MS標品對照HMDB、 MetAlign 、C-Clound數(shù)據(jù)庫已發(fā)表文件.25/45第25頁2.

11、5 代謝通路分析 D-GlucoseKEGGMetPAChemical ID Biochemical ID?代謝通路怎樣準確定位以D-Glucose為例26/45第26頁Labeling scheme for the Krebs cycle with pyruvate carboxylation using U13C-glucoseas tracer.Without labeled tracers, it is impractical to resolve the specic pathway(s) involved intheir production.2.5 代謝通路分析 J Biomol

12、 NMR () 49:267280.27/45第27頁 3 總結(jié)展望代謝組學是組學領域里唯一表觀察量，分析儀器飛速發(fā)展，到達了前所未有快速、靈敏、可靠和自動化，使得代謝組學中大數(shù)據(jù)集結(jié)果愈加可靠。對于樣本搜集、處理以及檢測等缺乏統(tǒng)一標準，給代謝組學研究帶來一定困擾。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學、蛋白組學及基因組學以及網(wǎng)絡藥理學等相關(guān)系統(tǒng)生物學技術(shù)和方法深入深入剖析疾病發(fā)生以及治療機制已經(jīng)成為一個趨勢。12328/45第28頁 4 研究內(nèi)容4.1 1H NMR代謝組學研究逍遙散抗抑郁療效4.2 1H NMR代謝組學研究驢膠補血顆粒補血作用機制4.3 GC-MS代謝組學研究沙棘籽油抗抑郁作用4.4 GC-MS代謝

13、組學研究逍遙散抑郁癥療效4.5 LC-MS代謝組學研究逍遙散抑郁癥療效4.6 臨床血漿樣本中OT、PGE2、PEF2LC-MS測定29/45第29頁4.1 1H NMR代謝組學研究逍遙散抗抑郁療效圖1 人體血漿1H NMR譜圖圖2 三組人體血漿樣本PLS-DA散點圖圖3 健康對照組以及抑郁癥患者治療前后OPLS-DA散點圖以及S-Plots圖4 與逍遙散抗抑郁作用相關(guān)代謝通路圖Fig.4.與逍遙散抗抑郁相關(guān)潛在生物標志物ROC曲線分析. (A) lactate; (B) TAMO; (C) phenylalaine. 30/45第30頁31/484.2 1H NMR代謝組學研究驢膠補血顆粒補血

14、作用機制圖1 大鼠血清1H NMR譜圖31/45第31頁32/484.3 GC-MS代謝組學研究沙棘籽油抗抑郁作用32/45第32頁33/484.4 GC-MS代謝組學研究逍遙散抑郁癥療效圖1 各組人體血漿樣本GC-MS總離子色譜圖（TIC）圖2 健康對照組以及抑郁癥患者服藥前后血漿代謝物PLS-DA散點圖（左）及其模型驗證圖（右）圖3 健康對照組與抑郁癥患者血漿代謝物OPLS-DA圖（A）以及s-plot（B）圖4 抑郁癥患者服藥前后樣本（訓練集）OPLS-DA散點圖(a)以及對應S-plot圖（b）；抑郁癥患者服藥前后樣本（驗證集）OPLS-DA散點圖（c）以及對應對應S-plot圖（d）

15、33/45第33頁差異代謝物及相關(guān)代謝通路分析精氨酸和脯氨酸代謝乙醛酸和二羧酸鹽代謝脂肪酸生物合成纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成34/45第34頁GC-MS測得血漿異代謝物ROC曲線分析圖1 訓練集(A)以及驗證集(B)中草酸和硬脂酸ROC曲線圖表1 差異代謝物ROC曲線下面積Liu, Cai-Chun, et al. Evaluating the Therapeutic Effects of Xiaoyaosan in Depressed Patients Using Gas Chromatography Mass Spectrometry (Phytomed icine , under

16、review).35/45第35頁4.5 LC-MS代謝組學研究逍遙散抑郁癥療效LC-MS譜圖 圖1 正離子模式下各組人體血漿代謝物LC-MS總離子流圖圖2 負離子模式下各組人體血漿代謝物LC-MS總離子流圖36/45第36頁37/48圖3 正負離子模式下四組血漿樣本PLS-DA散點圖（A）及其模型驗證圖（B）；負離子模式下四組血漿樣本PLS-DA散點圖（C）及其模型驗證圖（D） 多元統(tǒng)計分析PLS-DA散點圖中，正負離子模式下逍遙散組均介于抑郁癥組和健康對照組之間，表明逍遙散含有顯著抗抑郁癥療效。模型驗證圖中，正負離子模式下回歸線斜率較大而且Q20，表明PLS-DA模型質(zhì)量良好。正負離子模式

17、下，QC 樣本聚集在一起，該方法本研究所建立分析方法重復性和穩(wěn)定性符合大批量人體血漿樣本代謝組學分析要求。4.5 LC-MS代謝組學研究逍遙散抑郁癥療效37/45第37頁 多元統(tǒng)計分析圖4 正負離子模式下抑郁癥患者以及健康對照組血漿樣本OPLS-DA散點圖正負離子模式下，抑郁癥患者均與健康對照組顯著分開，表明與健康對照組相比，抑郁癥患者血漿代謝輪廓發(fā)生改變。4.5 LC-MS代謝組學研究逍遙散抑郁癥療效38/45第38頁 多元統(tǒng)計分析圖5 正離子模式下訓練集以及驗證集抑郁癥患者治療前后血漿樣本OPLS-DA散點圖及其S-plots圖6 負離子模式下訓練集以及驗證集抑郁癥患者治療前后血漿樣本OP

18、LS-DA散點圖及其S-plots經(jīng)逍遙散治療后，神經(jīng)酰胺（stearic amide和 palmitic amide），溶血性磷酸酰膽堿（LPC(C10:3)、LPC(C16:1)、LPC(21:4)、LPC(C19:0)、LPC(C18:0)、LPC(C23:5)和PC O 38:0、unknown）、肉堿（carnitine C10:4和carnitine C14:2）、植物鞘氨醇、環(huán)己烷十一酸、4-羰基2,3烯基己二酸、肌酐、硫胱醚、乙酰磷酸以及4-乙酰氨基丁酸等20種代謝物含量發(fā)生顯著性改變，說明逍遙散抗抑郁療效與這些代謝物調(diào)整相關(guān) 。4.5 LC-MS代謝組學研究逍遙散抑郁癥療效3

19、9/45第39頁 差異代謝物相關(guān)分析圖7 差異代謝物含量熱點圖（Class 1, 健康對照下；Class 2，抑郁癥組，Class 3逍遙散組，色帶-4-4 代表代謝物含量由高到低）與健康對照組相比，抑郁癥患者血漿中神經(jīng)酰胺（stearic amide和 palmitic amide），溶血性磷酸酰膽堿（LPC(C10:3)、LPC(C16:1)、LPC(21:4)、LPC(C19:0)、LPC(C18:0)、LPC(C23:5) 、PC O 38:0和 unknown）、肉堿（carnitine C10:4和carnitine C14:2）、植物鞘氨醇（Phytosphingosine）、環(huán)

20、己烷十一酸等代謝物含量降低高，4-羰基2,3烯基己二酸、肌酐、硫胱醚、乙酰磷酸以及4-乙酰氨基丁酸等代謝物含量升高，經(jīng)逍遙散治療后出現(xiàn)顯著回調(diào)。4.5 LC-MS代謝組學研究逍遙散抑郁癥療效40/45第40頁圖 8 差異代謝物含量與HAMD量表得分相關(guān)分析圖（MP1，甘油磷脂代謝；MP2，鞘脂代謝；MP3，脂肪胺代謝；MP4，脂肪酸代謝；MP5，精氨酸和脯氨酸代謝；MP6，?；撬岷蛠喤；撬岽x；MP7，半胱氨酸和蛋氨酸代謝） 差異代謝物相關(guān)相關(guān)分析神經(jīng)酰胺（stearic amide和palmitic amide），溶血性磷酸酰膽堿（LPC(C10:3)、LPC(C16:1)、LPC(21:4)、LPC(C19:0)、LPC(C18:0)、LPC(C23:5)、PC O 38:0和unknown）、肉堿（carnitine C10:4和carnitine C14:2）、植物鞘氨醇、環(huán)己烷十一酸等代謝物含量改變與HAMD量表得分成正相關(guān)，伴隨這些代謝物含量升高，抑郁癥量表得分越高，表明抑郁癥狀越嚴重；4-羰基2,3烯基己二酸、肌酐、硫胱醚、乙酰磷酸以及4-乙酰氨基丁酸等代謝物含量改