《核酸適體活性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》

1、核酸適體活性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范(征求意見稿)編制說明一、任務(wù)來源本國家標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)列入國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)二0一六年國家標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)“20161339-T-424”。本項(xiàng)任務(wù)由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口，定于2016年完成。本標(biāo)準(zhǔn)起草工作組由河北食品檢驗(yàn)研究院等單位共同組成。二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則本標(biāo)準(zhǔn)遵循GB/T1.1-2009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫和標(biāo)準(zhǔn)編寫內(nèi)容參考了與核酸適體篩選制備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范相關(guān)文獻(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)參照了 GB/T6379.1-2004測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度）第1部分總則與定義和 GB/T 6379.2-2004測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度第2

2、部分確定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法。標(biāo)準(zhǔn)制定的背景及意義20世紀(jì)以來，生物學(xué)飛速發(fā)展，人類不斷解密生命，不斷發(fā)現(xiàn)自我。幾十年來，核酸一直作為遺傳物質(zhì)被大眾所熟知。隨著脫氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）和蛋白質(zhì)相互作用研究的深入開展，Tuerk和Gold在1990年率先從含有8個(gè)隨機(jī)序列的RNA文庫中篩選到了能特異性結(jié)合噬菌體 T4 DNA聚合酶（gp43）的RNA序列，并將該技術(shù)命名為配體指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）。而后，Ellington和Szoata

3、k成功的運(yùn)用該技術(shù)從含150bp隨機(jī)序列的RNA庫中篩選到6種針對(duì)有機(jī)小分子染料的RNA寡核苷酸，并命名為“Aptamer”，國內(nèi)一般將其翻譯為為“適配體”、“核酸適（識(shí)）體”、“核酸適配子（體）”。1992年，Ellington和Szoatak又成功地從含有157bp的隨機(jī)序列ssDNA庫中篩選出cibacronblue、reactive green 19和 reactive blue 4的aptamer。從此，核酸適配體進(jìn)入人們的視野，并不斷在新的領(lǐng)域得到應(yīng)用。核酸適配體是經(jīng)體外篩選技術(shù)得到的，由十幾個(gè)或幾十個(gè)核苷酸組成的寡聚核苷酸片段（即ssDNA或RNA）。盡管ssDNA和RNA不同，

4、但是經(jīng)核磁共振及X射線晶體衍射等手段研究發(fā)現(xiàn)，SELEX技術(shù)篩選得到的兩種適配體都能夠折疊形成熱力學(xué)穩(wěn)定的特殊三維空間結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾（Hairpin）、莖環(huán)（Stem-Loop）、假結(jié)（Pseudoknot）和G-四聚體（G-tetramer），基于其單鏈核酸結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)的多樣性，適配體可通過結(jié)構(gòu)互補(bǔ)、堿基堆積力、范德華力、氫鍵和靜電等作用與靶分子特異性結(jié)合。SELEX技術(shù)通過靶分子與大容量化學(xué)合成的隨機(jī)寡核苷酸文庫作用，將所形成的靶分子-寡核苷酸復(fù)合物與游離寡核苷酸分離，再利用PCR體外擴(kuò)增技術(shù)對(duì)形成復(fù)合物的寡核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增。多次重復(fù)以上篩選步驟（一般需要420輪）以獲得親和力高、特異性好

5、的適配體。人工構(gòu)建的核酸庫一般包括正向引物序列、2060 個(gè)隨機(jī)核苷酸序列、反向引物序列3部分。通過對(duì)可與靶分子特異性結(jié)合的寡核苷酸進(jìn)行數(shù)輪反復(fù)的體外篩選、擴(kuò)增，達(dá)到指數(shù)級(jí)富集的效果，最終獲得與靶分子有特異結(jié)合作用的核酸適配體。SELEX技術(shù)篩選核酸適配體包括5個(gè)主要步驟，結(jié)合、分離、洗脫、擴(kuò)增和調(diào)節(jié)。其基本過程如圖1所示：首先建立一個(gè)隨機(jī)寡核苷酸文庫，庫容約10131015個(gè)，將靶分子加入到該文庫中，在特定的緩沖液體系和適宜的溫度下孵育，待靶分子與文庫中的隨機(jī)核苷酸充分結(jié)合后，再利用過濾、親和層析、磁珠分離、毛細(xì)管電泳等物理方法分離與靶分子結(jié)合的核苷酸序列。洗脫和收集結(jié)合的序列，PCR擴(kuò)增洗

6、脫收集的序列，集成富集的次級(jí)文庫，再與原靶分子進(jìn)行下一輪的篩選循環(huán)。每個(gè)靶分子要進(jìn)行620個(gè)連續(xù)循環(huán)，每輪篩選的同時(shí)，設(shè)立平行的親和力檢測(cè)試驗(yàn)，當(dāng)獲得的核酸文庫對(duì)靶分子的親和力不再增高，篩選過程就可停止。最后富集的文庫要通過克隆和測(cè)序來獲得最終特異識(shí)別靶分子的適配體。需要注意的是，大多數(shù)適配體與靶分子間的作用力為氫鍵，RNA文庫比DNA文庫更具有多樣性，但是所得適配體高度傾向被核酸酶結(jié)合。因此需要建立動(dòng)態(tài)組合文庫用新的方法來克服適配體化學(xué)穩(wěn)定性的問題。圖1 SELEX技術(shù)基本流程SELEX近年來獲得了快速發(fā)展，開發(fā)出了多種新型的篩選方法，大大提高了適配體的篩選周期和篩選效率，如以提高核酸適配體

7、選擇性為目的的篩選方法：反向篩選（counter SELEX）、消減篩選（subtractive SELEX）、光交聯(lián)篩選（photo SELEX）、負(fù)篩選（negative SELEX）；以提高核酸適配體普適性為目的的核酸適配體篩選方法：混合篩選（blended SELEX）、復(fù)合靶篩選（complex targets SELEX）、表達(dá)盒篩選（expression SELEX）、切換篩選（toggling SELEX）；以縮短篩選周期為目的的高效篩選方法：自動(dòng)化篩選（automated SELEX）、不放大篩選（non-SELEX）、熒光磁珠篩選（FluMag SELEX）；不同結(jié)合庫相結(jié)

8、合以增加目標(biāo)核酸適配體篩選機(jī)率的方法：加尾篩選（tailored SELEX）、基因篩選（genomic SELEX）。核酸適配體的功能與抗體很相似，核酸適配體分子的結(jié)合與抗原抗體的結(jié)合類似，但核酸適配體還具有更多的優(yōu)點(diǎn)：核酸適配體的靶分子范圍廣泛，除蛋白質(zhì)等大分子外，還能結(jié)合金屬離子、生物毒素、工業(yè)染料心等小分子，也可結(jié)合細(xì)胞氣病毒等8-9，被喻為“化學(xué)抗體”；核酸適配體寡核苷酸分子自身間可形成發(fā)夾（hairpin）、假結(jié)（pseudoknot）、凸環(huán)（bulge）或四聚體（G-quartet ）等空間結(jié)構(gòu)，并通過靜電、氫鍵、范德華力等非共價(jià)作用力，與靶分子間發(fā)生空間形狀切合的、高親和力、高

9、特異性的相互作用；核酸適配體還有以下幾方面優(yōu)勢(shì)：（1）篩選方便核酸適配體通過化學(xué)合成的方法得到，不依賴于生物體，避免了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，因此有可能篩選出沒有免疫源性或低免疫源性甚至具有毒性的靶分子的核酸適配體。通常制備免疫抗體至少需要3-6個(gè)月，而核酸適配體的篩選周期一般為2-3個(gè)月，有的甚至只需幾周。（2）易于修飾和標(biāo)記核酸適配體的末端易于連接一些活性基團(tuán)，容易固定在基質(zhì)上，可以在末端修飾一些指示基團(tuán)，便于進(jìn)行檢測(cè)。而抗體的修飾要困難得多。（3）特異性強(qiáng)，靶分子范圍廣核酸適配體對(duì)體外篩選靶分子有很高的特異性和親和力，目標(biāo)范圍廣泛，包含有機(jī)染料、氨基酸、蛋白質(zhì)、抗生素、多肽、維生素、藥物，甚至整個(gè)細(xì)胞

10、、致病菌、病毒、組織等。從理論上講，任何靶物質(zhì)都可以通過SELEX技術(shù)篩選得到相應(yīng)的核酸適配體。（4）親和力高核酸適配體與靶分子形成的復(fù)合物的解離常數(shù)Kd一般都在mmol/L級(jí)別，甚至可達(dá)到pmol/L水平。（5）穩(wěn)定性好相較于抗體的容易變性，核酸適配體具有較高的熱穩(wěn)定性，變性的適配體也很容易再生。且相對(duì)于蛋白質(zhì)抗體和酶，適配體的化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定，保存時(shí)間更長(zhǎng)，制成干粉可室溫保存，便于常溫下運(yùn)輸。（6）分子量小核酸適配體的分子量小，滲透性好，結(jié)合靶分子時(shí)空間位阻小，具有高通量篩選的潛力?；谏鲜龅膬?yōu)點(diǎn)，核酸適配體生物傳感器在眾多領(lǐng)域應(yīng)用的前景十分廣闊。比如說在常見的化學(xué)領(lǐng)域，疾病診斷領(lǐng)域、食品生

11、物安全領(lǐng)域、分子診斷領(lǐng)域、微生物檢測(cè)領(lǐng)域以及獸藥殘留的檢測(cè)等方面。目前已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)和銷售，但根據(jù)文獻(xiàn)、調(diào)研顯示，對(duì)于核酸適配體的篩選制備，目前仍然沒有形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，各生產(chǎn)和銷售廠商對(duì)核酸適配體篩選制備標(biāo)準(zhǔn)各自定義，結(jié)果差異顯著。鑒于此，開展核酸適配體篩選制備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范的制定，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，可有助于規(guī)范市場(chǎng)上此類產(chǎn)品的亂象，切實(shí)保障消費(fèi)者的使用。經(jīng)濟(jì)全球化浪潮使標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)上升到了戰(zhàn)略地位，特別是進(jìn)入21世紀(jì)以后，生物技術(shù)和生物產(chǎn)品發(fā)展迅速，發(fā)達(dá)國家紛紛制定包括核酸適配體在內(nèi)的各自的標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展戰(zhàn)略，以應(yīng)對(duì)因經(jīng)濟(jì)全球化對(duì)自身帶來的影響。此外，此類標(biāo)準(zhǔn)的制定也同樣滿足國家中長(zhǎng)期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展

12、規(guī)劃綱要（2006-2020年）中明確把實(shí)施技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)戰(zhàn)略作為我國科技發(fā)展的兩大戰(zhàn)略之一的目標(biāo)，有助于保障國家科學(xué)發(fā)展、社會(huì)和諧。標(biāo)準(zhǔn)工作過程（1）確立標(biāo)準(zhǔn)制定的基本原則，收集國際和國內(nèi)生物產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)。（2）比較與研究我國原國家標(biāo)準(zhǔn)及國際標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)內(nèi)容，并結(jié)合方法的研究工作，制定出標(biāo)準(zhǔn)的討論稿。（3）將標(biāo)準(zhǔn)討論稿提交專家組審查。（4）發(fā)出征求意見稿征求意見，匯總專家意見，根據(jù)專家意見對(duì)標(biāo)準(zhǔn)文本進(jìn)行完善。（5）提交核酸適體活性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通則（送審稿）、編制說明和征求意見匯總表供食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)審評(píng)委員會(huì)審議。標(biāo)準(zhǔn)的重要內(nèi)容1、標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容本標(biāo)準(zhǔn)包括7個(gè)部分，第1-3部分為范圍、引用和專業(yè)術(shù)語與定義，第4-7為細(xì)胞，大分子，小分子，復(fù)雜靶標(biāo)等不同層次靶標(biāo)體系的核酸適體與靶標(biāo)結(jié)合的性能評(píng)價(jià)和防污染措施。2、具體內(nèi)容（1）1-3部分為規(guī)定了核酸適配體活性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)、引用規(guī)范性文件和專業(yè)術(shù)語。包括核酸適體與靶標(biāo)結(jié)合的親和力和特異性的評(píng)價(jià)，確立核酸適體與靶標(biāo)結(jié)合的專一性和選擇性的方法驗(yàn)證，建立性能評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范。其中的核酸適配體適用范圍為不同層次靶標(biāo)體系。專業(yè)術(shù)語與定義包括對(duì)核酸適配體和平衡解離常數(shù)解釋說明。（2）4-7