醫(yī)學(xué)免疫學(xué)課件：流式細(xì)胞術(shù)在臨床及科研中的應(yīng)用

1、流式細(xì)胞術(shù)在臨床及科研中的應(yīng)用一、流式細(xì)胞儀工作原理二、熒光染料選擇三、樣本制備四、數(shù)據(jù)分析處理五、流式技術(shù)生命科學(xué)中的應(yīng)用 流式細(xì)胞技術(shù)及工作原理在流動(dòng)的狀態(tài)中快速檢測(cè)顆粒各種物理及生物特征的新型分析技術(shù)和分選技術(shù)；樣品的液流技術(shù) 細(xì)胞分選和計(jì)數(shù) 數(shù)據(jù)采集和分析流式技術(shù)是綜合高科技技術(shù)的結(jié)晶Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid流式細(xì)胞術(shù)能做什么？ 檢測(cè)懸浮的各類細(xì)胞或微粒 動(dòng)、植物細(xì)胞， 細(xì)菌，病毒 遺傳物質(zhì)（DNA,RNA)、 各種蛋白質(zhì)或其他分子。 還可以研究塑料微球或其他懸浮于液體中的微粒。 區(qū)分“死”

2、、 “活”細(xì)胞 鑒別“生物樣本”、與“非生物樣本” 測(cè)定細(xì)胞或顆粒的散射光、染色熒光、自發(fā)熒光 細(xì)胞分選 流式細(xì)胞儀原理檢測(cè)信號(hào)散射光信號(hào)前向散射光信號(hào)(FSC)：與激光束方向同軸的稱前向角散射光信號(hào)側(cè)向散射光信號(hào)(SSC)：與激光束垂直的稱為側(cè)向角散色光信號(hào)熒光信號(hào)流式細(xì)胞儀原理流式細(xì)胞儀原理前向角散射光信號(hào)（FSC）FSC反映細(xì)胞大小，一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞越大，前向角散射光信號(hào)越強(qiáng)；FSC信號(hào)與細(xì)胞的折射率有關(guān)；可用于表示細(xì)胞的凋亡；區(qū)分死/活細(xì)胞時(shí)，可用于設(shè)門 流式細(xì)胞儀原理側(cè)向角散射光信號(hào)（SSC）SSC信號(hào)主要反映了細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，SSC信號(hào)越強(qiáng)；流式細(xì)胞儀原理流式細(xì)胞儀原

3、理特征熒光信號(hào)當(dāng)熒光抗體或標(biāo)記其他染料染色的顆粒通過(guò)激光束時(shí)，染料吸收光子躍遷到激發(fā)態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，染料釋放出能量，大部分以光的形式釋放。這種發(fā)射出的光稱為熒光。 流式細(xì)胞儀原理激光光源波長(zhǎng): 488nm FITC PE, PE-CY5/PerCP 635nm APC影響因素：三穩(wěn)定一確保 熒光實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定 正壓光電系統(tǒng)穩(wěn)定 液流系統(tǒng)穩(wěn)定 確保單細(xì)胞懸液分散均勻，無(wú)過(guò)量雜質(zhì)混入 樣本制備 樣本制備可檢測(cè)的樣本種類多樣 外周血，骨髓、穿刺液，洗脫液，培養(yǎng)細(xì)胞 血清、血漿、培養(yǎng)上清、細(xì)胞裂解液 實(shí)體組織等 樣本制備細(xì)胞懸液制備 熒光標(biāo)記 新鮮組織標(biāo)本經(jīng)胰酶消化制備單細(xì)胞懸液 溶血 Ficoll梯度

4、離心獲得PBMC 細(xì)胞懸液濃度：106107/ml 活細(xì)胞的存活率90%肝、脾、淋巴節(jié)扁桃體等組織熒光染料的選擇 熒光染料的選擇每一種熒光染料有自己的激發(fā)波長(zhǎng)和相應(yīng)的發(fā)射波長(zhǎng)選擇熒光染料要考慮:流式細(xì)胞儀配置的激光可否激發(fā)該熒光染料流式細(xì)胞儀配置的光學(xué)收集系統(tǒng)可否檢測(cè)該熒光染料的發(fā)射波長(zhǎng)同時(shí)使用多種熒光染料時(shí)，要考慮熒光染料之間的干擾 熒光染料的選擇488nm激光激發(fā)的染料 熒光染料的選擇633nm激光激發(fā)的染料(APC)595 nm and 633 nm EXCITED DYES 熒光染料的選擇UV激光激發(fā)的染料 熒光染料的選擇常見(jiàn)熒光染料的發(fā)射波長(zhǎng) 熒光染料的選擇熒光染料的選擇不同的熒光素

5、有不同的發(fā)射光強(qiáng)度；能否區(qū)分陽(yáng)性與陰性，與選用何種熒光染料標(biāo)記的抗體密切相關(guān)；高表達(dá)的抗原幾乎可以用任何熒光素標(biāo)記的抗體檢測(cè)，而較低表達(dá)的抗原則需要用較高S/N比值的熒光素（如PE和APC）標(biāo)記的抗體檢測(cè)； 熒光染料信號(hào)的“強(qiáng)弱”與所用的流式細(xì)胞儀也有關(guān)系，同一份樣本在不同型號(hào)流式細(xì)胞上檢測(cè)的結(jié)果會(huì)不同；這種差異主要是因?yàn)楣鈱W(xué)系統(tǒng)的不同； 熒光染料的選擇非特異結(jié)合有些熒光標(biāo)記的抗體表現(xiàn)出低水平的非特異結(jié)合，會(huì)造成陰性細(xì)胞的熒光水平升高。有些染料如（Cy3、Cy5和Cy5.5）和Texas Red直接標(biāo)記的抗體，以及某些復(fù)合染料如ECD，與某些細(xì)胞亞群的結(jié)合性增強(qiáng)。 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)顯示：

6、單參數(shù)直方圖 二維點(diǎn)圖 二維等高圖 假三維圖及列表模式數(shù)據(jù)分析： 檢測(cè)指標(biāo)陽(yáng)性百分率（%）絕對(duì)計(jì)數(shù)（個(gè)/ L ）平均熒光強(qiáng)度（MFI） 數(shù)據(jù)分析設(shè)門用來(lái)限定感興趣的細(xì)胞群；FSC vs SSC點(diǎn)圖是傳統(tǒng)上用于設(shè)門的圖；分析淋巴細(xì)胞群時(shí)，CD45 vs SSC點(diǎn)圖設(shè)門更優(yōu)于FSC vs SSC點(diǎn)圖設(shè)門； 數(shù)據(jù)分析設(shè)門-確定要分析的目的細(xì)胞群Side ScatterForward Scatter0200400600800100002004006008001000R1 數(shù)據(jù)分析設(shè)門100101102103104SSC-HeightR1CD3-PE100101102103104100101102103

7、104Anti-HLA-DR FITCGated on R1100101102103104CD25-PE 數(shù)據(jù)分析對(duì)照樣本 檢測(cè)樣本 數(shù)據(jù)分析直方圖統(tǒng)計(jì)表 數(shù)據(jù)分析點(diǎn)圖統(tǒng)計(jì)表對(duì)照樣本檢測(cè)樣本流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)展 多激光，多色分析 增加檢測(cè)參數(shù)而不影響檢測(cè)靈敏度， 新熒光染料的開(kāi)發(fā) 紫外光激發(fā)的Pacific Blue，Alexa Fluora 405； 藍(lán)光激發(fā)的Alexa Fluora 488； 紅光激發(fā)的Alexa Fluora 647; 熒光耦連物，如PE-Cy5，APC-Cy7，PerCP-Cy5.5 等電子系統(tǒng)數(shù)字化 熒光間補(bǔ)償?shù)恼{(diào)整也更加簡(jiǎn)單,并可以脫機(jī)補(bǔ)償 。流式細(xì)胞儀臨床應(yīng)用的新進(jìn)

8、展 多色分析：提高了流式細(xì)胞分析的信息量絕對(duì)計(jì)數(shù)：?jiǎn)纹脚_(tái)絕對(duì)計(jì)數(shù)方法熒光定量分析：可以判斷細(xì)胞上抗原表達(dá)密度，細(xì)胞熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，細(xì)胞抗原表達(dá)密度也越高微生物分析：直接對(duì)微生物顆粒進(jìn)行分析，快速靈敏，尤其適合生長(zhǎng)緩慢的微生物，如分支桿菌，一些霉菌等 熒光定量分析 （QFC)判斷細(xì)胞上抗原表達(dá)密度，細(xì)胞熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，細(xì)胞抗原表達(dá)密度也越高熒光定量分析可以有效區(qū)分弱表達(dá)與強(qiáng)表達(dá)。熒光定量分析可以消除不同儀器檢測(cè)檢測(cè)誤差，使不同儀器間的結(jié)果具有較好的可比性。在細(xì)胞的發(fā)育分化過(guò)程或疾病進(jìn)程中，細(xì)胞某一抗原可能持續(xù)表達(dá)，但其表達(dá)密度隨細(xì)胞變化而改變，這時(shí)就需要進(jìn)行細(xì)胞的熒光定量分析了。 流式細(xì)胞技術(shù)在生命

9、科學(xué)中的應(yīng)用細(xì)胞表面抗原分子的測(cè)定細(xì)胞凋亡檢測(cè)細(xì)胞因子測(cè)定（胞內(nèi)、胞外）在腫瘤學(xué)方面的應(yīng)用在血液學(xué)方面應(yīng)用細(xì)胞分選淋巴細(xì)胞免疫分型T-細(xì)胞亞群（CD4/CD8/CD3） 早期活化T亞群（CD4/CD69/CD8） 活化T淋巴細(xì)胞（CD3/HLA-DR） 活化的T細(xì)胞亞群（CD4/CD25/CD8） 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞: D4+CD25+/CD8+CD25+ B-淋巴細(xì)胞（CD3/CD19） B-淋巴亞群（CD19/CD5） NK細(xì)胞 （CD16/56)淋巴細(xì)胞亞群分析臨床意義-機(jī)體免疫狀態(tài)的評(píng)價(jià)通過(guò)對(duì)機(jī)體免疫狀態(tài)的檢測(cè)可了解在不同情況下體內(nèi)免疫功能狀態(tài),探索疾病的發(fā)病機(jī)理、跟蹤病程、判斷預(yù)后，監(jiān)測(cè)、

10、指導(dǎo)臨床治療方案。淋巴細(xì)胞亞群分析臨床意義感染性疾病病毒性肝炎乙肝感染后,一方面通過(guò)體液免疫阻止病毒感染,減少病毒載量,另一方面細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在清除病毒和肝細(xì)胞破壞上起了雙重的作用。一般CD8+百分比比增高。監(jiān)測(cè)治療：病毒的清理主要通過(guò)細(xì)胞因子,尤其是TNF和IFN.這一過(guò)程對(duì)肝細(xì)胞并不造成損害.判斷預(yù)后：病人的預(yù)后有賴于病毒載量和機(jī)體免疫狀態(tài)之間的平衡。淋巴細(xì)胞亞群分析臨床意義感染性疾病ADIS T淋巴細(xì)胞總數(shù)減少 T細(xì)胞亞群（CD3+CD4+/CD3+CD8+）比例倒置，Th/Ts1.0 Th細(xì)胞(CD4+細(xì)胞)絕對(duì)計(jì)數(shù)10-15% DNA倍體分析：結(jié)合臨床病理的形態(tài)學(xué)診斷，對(duì)一些惡性

11、腫瘤進(jìn)行早期診斷，跟蹤隨訪和早期治療，大大提高一些腫瘤的治愈率和生存率。尤其對(duì)一些細(xì)胞抽吸物、體液、組織液的脫落細(xì)胞的分析，意義尤為重要。增殖狀態(tài)分析：反映了腫瘤的生長(zhǎng)速度和侵襲性 組織標(biāo)本準(zhǔn)備新鮮組織標(biāo)本：機(jī)械法或胰酶消化制備單細(xì)胞懸液冰凍組織標(biāo)本：組織復(fù)蘇 機(jī)械法制備單細(xì)胞懸液石蠟組織標(biāo)本： 脫臘：二甲苯浸泡石蠟組織切片脫石蠟（12天） 水化：梯度酒精到蒸餾水組織逐步水化 （每步10min) 消化：胃蛋白酶解聚分散組織細(xì)胞間的蛋白物質(zhì) （370C，30分鐘 ） 過(guò)濾收集細(xì)胞：300目篩網(wǎng) 細(xì)胞凋亡檢測(cè)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡的研究?jī)?nèi)容Annexin V細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸檢測(cè)Caspases細(xì)胞酶的檢測(cè)DNA 含量分析調(diào)亡相關(guān)蛋白：Fas、Bcl-2細(xì)胞凋亡Annexin ANNEXIN V標(biāo)記檢測(cè)凋亡凋亡細(xì)胞死亡細(xì)胞活細(xì)胞細(xì)胞凋亡DNA分析PI - Fluorescence# Events調(diào)亡細(xì)胞正常G0/G1期細(xì)胞 在血液學(xué)方面應(yīng)用血小板檢測(cè)網(wǎng)織RBC計(jì)數(shù)PNH檢測(cè)干細(xì)胞檢測(cè)骨髓CD34細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)白血病免疫分型 白血病免疫分型正常骨髓表型 異常骨髓表型白血病與淋巴瘤的免疫分型 細(xì)胞功能檢測(cè)膜電位檢測(cè)Ca2+檢測(cè)：胞內(nèi)鈣離子對(duì)調(diào)控細(xì)胞的多種代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起著至關(guān)重要的作用熒光染料