分子生物學(xué)講座

1、分子生物學(xué)講座第1頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一原核生物啟動(dòng)子第2頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一2、真核生物啟動(dòng)子的基本結(jié)構(gòu) 真核生物的啟動(dòng)子有其特殊性，真核生物有多種RNA聚合酶，每一種都有自己的啟動(dòng)子類型。以RNA聚合酶的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)為例，人們比較了上百個(gè)真核生物RNA聚合酶的啟動(dòng)子核苷酸序列的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在-25區(qū)有TATA框，又稱為Hogness框或Goldberg-Hogness框。其一致序列為T28A97A93A85A63T37A83A50T37，基本上都由A，T堿基所組成，又叫 TATA框。Hogness boxTATA box -

2、75區(qū)-25區(qū)+1，起始點(diǎn)上游CAAT box第3頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一 TATA框決定了轉(zhuǎn)錄的起始部位，即RNA聚合酶要和它結(jié)合才可以開始轉(zhuǎn)錄。CAAT框則決定了轉(zhuǎn)錄的起始頻率。 由于真核生物突變體的誘導(dǎo)和鑒定非常困難，所以，真核生物啟動(dòng)子的研究遠(yuǎn)比原核生物困難。 除啟動(dòng)子外，真核生物轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游處還有一個(gè)稱為增強(qiáng)子的序列，它能極大地增強(qiáng)啟動(dòng)子的活性，它的位置往往不固定，可存在于啟動(dòng)子上游或下游。 第4頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一 在原核生物中，當(dāng)RNA聚合酶的亞基發(fā)現(xiàn)其識(shí)別位點(diǎn)（ -35區(qū)）時(shí)，全酶就與啟動(dòng)子的-35區(qū)序列結(jié)合

3、形成一個(gè)封閉（指DNA為雙鏈狀態(tài)）的啟動(dòng)子復(fù)合物。由于全酶分子較大（大約可以覆蓋70bp的長(zhǎng)度），其另一端可到達(dá)-10區(qū)。這時(shí)，整個(gè)酶分子向-10序列轉(zhuǎn)移并與之牢固結(jié)合，在此處發(fā)生局部DNA的解鏈（一般在12-17bp左右），形成全酶和啟動(dòng)子的開放性（DNA為單鏈狀態(tài)）復(fù)合物。三、轉(zhuǎn)錄的開始和延伸第5頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一 在復(fù)合物中起始位點(diǎn)和延長(zhǎng)位點(diǎn)被相應(yīng)的核苷酸充滿，在RNA聚合酶亞基催化下形成RNA的第一個(gè)磷酸二酯鍵。RNA合成的第一個(gè)核苷酸總有GTP或ATP，以GTP常見。 此時(shí)因子就完成了它這一次起始的使命，從全酶解離下來(lái)，靠核心酶在DNA鏈上向下游

4、滑動(dòng)，而脫落的因子與另一個(gè)核心酶結(jié)合成全酶，可以反復(fù)利用。第6頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一第7頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一第8頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一 真核生物的轉(zhuǎn)錄起始機(jī)制非常復(fù)雜，還不是很清楚。因?yàn)橛卸喾N轉(zhuǎn)錄酶，每一種都有它的特異性。但是，可以知道的是，有許多蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子要參與起始和延伸。（參考p408-410） 轉(zhuǎn)錄的速度：30-50bp/秒，但不是恒定的，會(huì)有變化。第9頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一四、轉(zhuǎn)錄的終止（Termination) 轉(zhuǎn)錄是在DNA模板某一位置上停止

5、的，人們比較了若干原核生物RNA轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)附近的DNA序列，發(fā)現(xiàn)DNA模板上的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)有兩種情況: 一類是不依賴于蛋白質(zhì)因子而實(shí)現(xiàn)的終止作用， 一類是依賴蛋白質(zhì)輔因子才能實(shí)現(xiàn)終止作用，這種蛋白質(zhì)輔因子稱為釋放因子，通常又稱因子。 兩類終止信號(hào)有共同的序列特征，在轉(zhuǎn)錄終止之前有一段回文結(jié)構(gòu)。第10頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一不依賴因子的終止序列中富含GC堿基對(duì)，其下游6-8個(gè)A。依賴因子的終止序列中GC堿基對(duì)含量較少，其下游序列也沒有固定的特征，轉(zhuǎn)錄生成的RNA可形成二級(jí)結(jié)構(gòu)即柄一嚕噗結(jié)構(gòu)，又稱發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這樣的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能與RNA聚合酶某種特定的空間結(jié)構(gòu)相嵌合，

6、阻礙了RNA聚合酶進(jìn)一步發(fā)揮作用 。除DNA模板本身的終止信號(hào)外，在噬菌體中，發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)有協(xié)助RNA聚合酶跨越終止部位的作用，叫抗轉(zhuǎn)錄終止蛋白。終止序列的特征：第11頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一真核生物由于RNA轉(zhuǎn)錄后很快就進(jìn)行了加工，因此很難確定原初轉(zhuǎn)錄物的3末端。病毒SV40的終止位點(diǎn)經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，很像大腸桿菌的不依賴因子的終止子，轉(zhuǎn)錄后的RNA可形成一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，3末端帶有一連串的U。爪蟾5sRNA的3末端有4個(gè)U，它們前后的序列為富含GC的序列，這是所有真核生物RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄的終止信號(hào)。這種序列特征高度保守，從酵母到人都很相似，任何改變這種序列特征的突

7、變都將導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止位置的改變。 第12頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一第13頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一第14頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一第15頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一第二節(jié) RNA轉(zhuǎn)錄后的加工與修飾 提示：原核或真核生物的rRNAs和tRNAs都是以初級(jí)轉(zhuǎn)錄本(transcript)形式被合成的，然后加工成為成熟的RNA分子。絕大多數(shù)原核生物的mRNA卻不需加工，仍為初級(jí)轉(zhuǎn)錄本的形式。真核生物產(chǎn)生的mRNA要經(jīng)過復(fù)雜的加工才能成為成熟的RNA。加工過程大致分為四種。第16頁(yè)，共28

8、頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一一、mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工1、原核生物 轉(zhuǎn)錄生成的一條mRNA可以包含幾個(gè)基因，有共同的啟動(dòng)子和共同終止信號(hào)，編碼幾種不同的蛋白質(zhì)。例如乳糖操縱子上的Z、Y及A基因，轉(zhuǎn)錄生成的mRNA可翻譯生成三種酶，即半乳糖苷酶，透過酶和乙酰基轉(zhuǎn)移酶。原核生物中沒有核膜，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是連續(xù)進(jìn)行的，往往轉(zhuǎn)錄還未完成，翻譯已經(jīng)開始了，因此原核生物中轉(zhuǎn)錄生成的mRNA沒有特殊的轉(zhuǎn)錄后加工修飾過程。 第17頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一2、真核生物 真核生物轉(zhuǎn)錄一個(gè)mRNA分子，只編碼一種蛋白質(zhì)分子。真核生物mRNA的加工修飾，主要包括對(duì)5端和

9、3端的修飾以及對(duì)中間部分進(jìn)行剪接。（1）加帽：轉(zhuǎn)錄開始后，mRNA就會(huì)通過鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶在5端催化產(chǎn)生5-5之間的磷酸二酯鍵。再通過鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶在G7位甲基化，這種帽子叫“0型帽子”。用符號(hào)表示：m7GpppX 。在酵母當(dāng)中，這種類型的帽子占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。第18頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一 如果在第一個(gè)核苷酸的2-O位上再發(fā)生甲基化，則形成了“2型帽子”，符號(hào)表示為：m7GpppXm 。這種形式是除了單細(xì)胞真核生物以外的其他大多數(shù)真核生物帽子的主要形式。 在某些真核生物中，還存在著第二個(gè)核苷酸（可以是四種中的任何一個(gè)）的2-O位上再發(fā)生甲基化的情況，這樣就產(chǎn)生了“3

10、型帽子”。用符號(hào)表示為：m7GpppXmpYm，這種類型比較少，只有戴帽子mRNA的10-15%左右。 不同生物的帽子結(jié)構(gòu)不同，進(jìn)化程度高，結(jié)構(gòu)越復(fù)雜。第19頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一三種不同的5端“帽子”第20頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一三種不同的5端“帽子”第21頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一（2）5帽子的作用：主要包括： 它是mRNA 做為翻譯起始的必要的結(jié)構(gòu)，對(duì)核糖體對(duì)mRNA的識(shí)別提供了信號(hào)?！?型帽子”是核糖體識(shí)別mRNA的必需結(jié)構(gòu)。體外翻譯試驗(yàn)表明，沒有帽子的mRNA，不能進(jìn)行有效的翻譯。 這種帽

11、子結(jié)構(gòu)還可能增加mRNA的穩(wěn)定性，保護(hù)mRNA 免遭5外切核酸酶的攻擊。 幫助其從核內(nèi)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)里。 大多數(shù)的RNA病毒都可以在他們的基因組和mRNA上加帽，有些自己不能加帽的可以從宿主細(xì)胞的mRNA中偷帽子，叫“搶帽”（cap-snatching）。第22頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一（3）多聚腺苷酸尾巴大多數(shù)（2/3）的真核mRNA 都有3端的多聚（A)尾巴，多聚（A)尾巴大約為200bp。多聚（A)尾巴不是由DNA編碼的，而是轉(zhuǎn)錄后在核內(nèi)加上去的。此反應(yīng)受poly（A）聚合酶（又叫RNA末端腺苷酸轉(zhuǎn)移酶）催化，并加上約200個(gè)A殘基。 過程：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3末端由

12、一個(gè)特異酶切除一端，該酶可以識(shí)別這個(gè)酶切位點(diǎn)上游13-20bp附近的特殊序列AAUAAA，此序列高度保守，又叫“加尾信號(hào)”。如果U發(fā)出突變，則切除和加尾效率明顯降低。第23頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一第24頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一（4） polyA尾巴功能： 關(guān)于polyA尾巴的功能問題盡管經(jīng)過極其廣泛的探索，但還不完全清楚。有人推測(cè)polyA可能與mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)送到細(xì)胞質(zhì)有關(guān)，但是相當(dāng)數(shù)量的沒有polyA尾巴的mRNA如組蛋白mRNA，也照樣通過核膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。還有人認(rèn)為這種結(jié)構(gòu)對(duì)真核mRNA的翻譯效率具有某種作用，并能穩(wěn)定mR

13、NA結(jié)構(gòu)，保持一定的生物半衰期。有人也認(rèn)為和小核RNA（snRNA）有關(guān)。snRNA不是單獨(dú)起作用 。第25頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一二、rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工原核生物原核生物大腸桿菌有三種rRNA，即5S，16S和23S，分別有120bp，1541bp和2904bp。其中5S的核苷酸中有一段保守序列，可以和tRNA的TC環(huán)結(jié)合，是二者相互識(shí)別的位點(diǎn)。 原核生物rRNA轉(zhuǎn)錄后加工，包括以下幾方面：第26頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一大腸桿菌中有7種操縱子，這些操縱子中排列著rRNA和tRNA基因，其中rRNA 首先合成一個(gè)30S的前體；前體被大腸桿菌的RNase，RNaseE等剪切成一定鏈長(zhǎng)的rRNA分子；rRNA分子在修飾酶催化下進(jìn)行堿基修飾；rRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核糖體的大、小亞基 。第27頁(yè)，共28頁(yè)，2022年，5月20日，10點(diǎn)0分，星期一真核生物真核生物rRNA前體