無菌、微生物限度檢查及方法驗(yàn)證要點(diǎn)

1、無菌、微生物限度檢查及方法驗(yàn)證要點(diǎn)安徽省食品藥品檢驗(yàn)所 李瑋1菌種、培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境管理無菌檢查及方法驗(yàn)證微生物限度檢查及方法驗(yàn)證2010年版藥典增修訂情況2菌（毒種）管理辦法 1. 菌種保管應(yīng)有專人負(fù)責(zé)，保存于冰箱中，房門專人加鎖，確保菌種安全（烈性菌種雙人雙鎖）。保管人員變動時(shí)，必須嚴(yán)格交接手續(xù)。 2.實(shí)驗(yàn)用菌種均從CMCC購置。菌種的申購，由保管人根據(jù)菌種保存情況，提出申購，經(jīng)上級負(fù)責(zé)人簽字批準(zhǔn)。申購單應(yīng)注明菌種名稱、菌號、數(shù)量及請購人。從指定單位購到菌種后，應(yīng)逐一核對菌種名稱、菌號、數(shù)量，無誤后方可接種，應(yīng)做好記錄。 3.菌種應(yīng)有嚴(yán)格的登記，包括形態(tài)，分離日期，鑒定日期，簽發(fā)者，主要

2、鑒定性能，并注明使用、轉(zhuǎn)移、銷毀情況及原因。 4.菌種的轉(zhuǎn)種等均應(yīng)在超凈工作臺進(jìn)行，以防污染。 5.各種菌種應(yīng)按規(guī)定時(shí)間接種，一般在接種三次后作一次全面的鑒定，注意菌種有無污染及變異，如發(fā)現(xiàn)變異時(shí)，應(yīng)及時(shí)更換。 3所有存在菌種應(yīng)具備清單。 保存的菌、毒種傳代或凍干均應(yīng)填寫專用記錄，菌種管上應(yīng)有牢固的標(biāo)簽，標(biāo)明菌種編號、代次、批號、日期培養(yǎng)、在藥品微生物檢查時(shí)，可進(jìn)行簡單的染色鏡檢，以保證在試驗(yàn)中所用菌種的正確。致病菌與普通菌種要分開管理。保存的菌種傳代、移種后，銷毀原菌種之前，應(yīng)仔細(xì)檢查新舊菌種的標(biāo)簽是否正確。4菌種的分類三類：僅具一般性危險(xiǎn)，能引起實(shí)驗(yàn)室感染的機(jī)會較少，一般的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室采

3、用一般實(shí)驗(yàn)技術(shù)能控制感染或有對其有效的免疫預(yù)防方法的菌種。四類：生物制品、菌苗、疫苗生產(chǎn)用各種減毒、弱毒菌種及不屬于上述一、二、三類的各種低致病性的微生物菌種。5微生物與生物安全實(shí)驗(yàn)室適用級別二級生物安全實(shí)驗(yàn)室（BSL-2）：登革熱病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、流感病毒等。腦膜炎奈瑟氏菌、肺炎鏈球菌、軍團(tuán)菌、白喉棒桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、致病性大腸埃希氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、空腸彎曲菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、非典型結(jié)核分枝桿菌等。鉤端螺旋體、致病性支原體、鸚鵡熱衣原體、放線菌、青霉菌等。 6驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)常用菌種枯草芽孢桿菌 CMCC（B）635

4、01金黃色葡萄球菌 CMCC（B）26003生孢梭菌 CMCC（B）64941銅綠假單胞菌 CMCC（B）10104大腸埃希菌 CMCC（B）44102乙型副傷寒沙門菌 CMCC（B）50094白色念珠菌 CMCC（F）98001黑曲霉 CMCC（F）9 0037細(xì)菌室消毒隔離措施1.每天工作前用消毒液消毒工作臺，上班前、下班后開紫外燈（最少半小時(shí)）進(jìn)行空氣消毒。 2.非必要品禁止帶入實(shí)驗(yàn)室，必要資料和書籍帶入后，應(yīng)遠(yuǎn)離操作臺。 3.使用后的載玻片、蓋片、平皿、試管等用消毒液浸泡，經(jīng)煮沸后清洗或丟棄。 4.試驗(yàn)后的血液標(biāo)本用消毒液浸泡后煮沸消毒，所有用于試驗(yàn)的反應(yīng)板、吸頭等用消毒液浸泡（至少2

5、4小時(shí)以上）后清洗或丟棄。 5.所有微生物培養(yǎng)物（細(xì)菌、支原體、真菌等培養(yǎng)物），不管標(biāo)本陽性或陰性均用消毒液浸泡后，經(jīng)煮沸消毒，才能清洗或丟棄。8染菌物出試驗(yàn)時(shí)及試驗(yàn)后將染菌/帶菌物品放于盛有的苯扎溴銨溶液的滅菌專用桶中浸泡。滅菌專用桶加蓋，送集中洗滌室熱壓滅菌。將滅菌桶在12130min的條件下進(jìn)行高壓濕熱滅菌，滅菌后再取出清洗。高壓蒸汽滅菌效果驗(yàn)證9菌種保藏步驟干燥菌種復(fù)蘇，劃平板挑選特征典型的純菌菌落；（制菌懸液使用）確定保藏的合適菌體形態(tài)；選擇最適宜的保藏方法，定期對保藏菌種進(jìn)行檢查，觀察是否發(fā)生變化，若有變化，須改變保藏方法。保藏期滿應(yīng)及時(shí)進(jìn)行移種。10瓊脂斜面低溫保存法（廠家常用）

6、方法：將典型菌落接種在斜面（特殊菌種可用液體培養(yǎng)基）上，按規(guī)定培養(yǎng)，待充分生長后，把培養(yǎng)好的新鮮菌種用牛皮紙保好，可將菌種保藏管的棉花塞換成橡膠塞。放在4左右的冰箱中保藏。每隔 23個(gè)月移種一次。若用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，一般可保藏半年 一年。適用范圍：細(xì)菌、酵母菌、霉菌保藏。優(yōu)點(diǎn):簡便，對大多數(shù)微生物都適用。 缺點(diǎn):保藏期太短；傳代次數(shù)多，易發(fā)生變異及污染。11冷凍真空干燥保藏法 主要是將待保藏菌種混于有保護(hù)作用介質(zhì)內(nèi)制成菌液，分裝在安瓿中于冷凍條件下使其快速凍結(jié)，因凍結(jié)可使晶形細(xì)致，不致?lián)p傷活菌細(xì)胞。然后用真空抽氣減壓，是安瓿內(nèi)的冰晶液體升華，水氣迅速被真空抽走，冰晶型的菌液很快變成疏

7、松的干燥固體物，最后在真空狀態(tài)下熔封管口，使干燥物在局部真空條件下封存，并置冷暗處，在很長時(shí)間內(nèi)菌種仍可維持活力不變。12試驗(yàn)用菌種的培養(yǎng)傳代方法 （一）菌種的復(fù)蘇 （二）菌種的傳代與保存 （三）對照用菌液的制備 檢定用標(biāo)準(zhǔn)菌種，由中國藥品生物檢定所提供，為冷凍干燥菌種。菌種的復(fù)蘇在專用無菌室或超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行。傳代與保存:方法1：菌斜面,方法2：凍存管13傳代：取菌液接種至10ml液體培養(yǎng)基，按規(guī)定培養(yǎng)、稀釋傳代限制（5代）對照用菌種在使用過程中，亦應(yīng)檢查其生物學(xué)特性。如菌落形態(tài)、革蘭染色、鏡檢菌體形態(tài)、主要生化特性。如發(fā)現(xiàn)染菌或變異，衰退等現(xiàn)象時(shí)，應(yīng)及時(shí)處理。菌種分離14培養(yǎng)基管理 一般采

8、用購自中國藥品生物制品檢定所合格的商品脫水培養(yǎng)基。同時(shí)按照使用說明書進(jìn)行配制，需注意培養(yǎng)基的pH值應(yīng)符合規(guī)定，否則必須校正后，按說明書規(guī)定滅菌使用。商品脫水培養(yǎng)基應(yīng)在效期內(nèi)使用，使用前應(yīng)注意核對名稱，檢查外觀，遇有接塊、吸潮現(xiàn)象，應(yīng)廢棄。新鮮培養(yǎng)基的配制，應(yīng)按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的配方進(jìn)行。對培養(yǎng)基的原材料要進(jìn)行挑選，試劑應(yīng)為化學(xué)純試劑規(guī)格。制成的培養(yǎng)基要求無沉淀，必要時(shí)以適當(dāng)方法過濾，調(diào)整pH值，分裝滅菌備用。 15培養(yǎng)基性能的質(zhì)量控制 無菌檢查用需氣厭氣培養(yǎng)基的指示劑氧化層不得超過培養(yǎng)基深度的1/5，否則需經(jīng)水浴煮沸10分鐘，但只限加熱一次。無菌檢查結(jié)束時(shí)，指示劑氧化層應(yīng)不超過培養(yǎng)基深度的1/2。

9、大腸埃希菌檢查用MUG培養(yǎng)基配制前應(yīng)挑選無熒光的試管進(jìn)行配制，觀察結(jié)果時(shí)應(yīng)用同批培養(yǎng)基配制的空白管和陽性菌管同時(shí)觀察。對無菌培養(yǎng)基的無菌性、靈敏度檢查16培養(yǎng)基的靈敏度檢查:（已知菌生長試驗(yàn)）細(xì)菌組： 取每管裝量為12ml 硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基9支，分別接種小于100cfu 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌試驗(yàn)菌各2支; 空白對照：另一支不接種，溫度培養(yǎng)2472小時(shí)逐日觀察結(jié)果霉菌組： 取每管裝量為9 ml的改良馬丁液體培養(yǎng)基5支，分別接種小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支； 空白對照：另一支不接種，培養(yǎng)5天。逐日觀察結(jié)果。 結(jié)果判定 空白管培養(yǎng)基無菌生長，加菌的培

10、養(yǎng)基管均生長良好，判靈敏度檢查合格。17培養(yǎng)基管理配制好的培養(yǎng)基，按無菌要求進(jìn)行滅菌。培養(yǎng)基的配制須有記錄，記錄內(nèi)容含有：a）配制日期和配制人員的標(biāo)識；b）培養(yǎng)基/溶液的類型、體積；c）成分、每個(gè)成分物質(zhì)的含量、制造商、批號；d）pH（最初和最終）值；e）無菌措施，包括實(shí)施的方式、時(shí)間和溫度。按日期編制滅菌后的培養(yǎng)基批號。將制備完畢的培養(yǎng)基按品種放置在陰涼的指定位置，備用。注意保存期。18a.濕熱高壓蒸汽滅菌法：依115 121或132，應(yīng)用于培養(yǎng)基滅菌、試驗(yàn)器械、工作服、橡膠物品滅菌和實(shí)驗(yàn)室廢棄物，也可用于玻璃器皿的滅菌。一般12130min 因?yàn)闈駸嶂芯w吸水，蛋白質(zhì)容易凝固，因蛋白質(zhì)含水

11、量增加，所需凝固溫度降低；濕熱的蒸氣有潛熱存在。所以效果比同溫度下干熱好。b.干熱法：利用物理學(xué)，171-1小時(shí)、160-2小時(shí)、121-3小時(shí) : 玻璃器皿19潔凈工作室1 無菌檢查實(shí)驗(yàn)室分無菌操作間和緩沖間 2 進(jìn)入無菌操作間應(yīng)有人凈和物凈的設(shè)施3 無菌操作間內(nèi)禁放雜物，每次實(shí)驗(yàn)后清潔消毒,并定期清潔、滅菌,每周徹底消毒一次,臭氧,消毒液0.1%新潔爾滅/75%酒精/其他交替使用4無菌操作間定期進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測，可訂為 2周3月，平時(shí)實(shí)驗(yàn)中實(shí)時(shí)做 5 無菌間使用的拖鞋要定期消毒處理6 無菌間內(nèi)紫外線燈要定期進(jìn)行更換7實(shí)驗(yàn)前啟動凈化系統(tǒng)1小時(shí),紫外燈1小時(shí)以上20無菌檢查：注射劑、植入劑、部分外

12、用藥鼻用制劑：用于手術(shù)或創(chuàng)傷的鼻用制劑。凝膠劑：用于嚴(yán)重創(chuàng)傷的凝膠劑。乳膏劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的乳膏劑。新增的無菌檢查中藥制劑散劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的外用散劑。鼻用制劑：用于嚴(yán)重創(chuàng)傷的鼻用制劑。眼用制劑：用于傷口的眼用制劑。軟膏劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的乳膏劑。氣霧劑、噴霧劑：用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的氣霧劑、噴霧劑。21無菌檢查基本定義：檢查要求無菌的藥品.醫(yī)療器具.原料.輔料.以及要求無菌的其他物品是否染有活菌的一種方法。符合無菌檢查法的規(guī)定僅表明了供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和真菌污染。說明無菌檢查法建立在批產(chǎn)品受微生物污染是均勻的假設(shè)上。即使該批產(chǎn)品的污染非常均勻，檢出低污染的概率也是極

13、低的。因此，無菌檢查存在風(fēng)險(xiǎn)和局限性。應(yīng)盡量抽取批產(chǎn)品生產(chǎn)開始和結(jié)束或生產(chǎn)過程出現(xiàn)異常情況下的產(chǎn)品進(jìn)行檢查。22藥品生產(chǎn)中的污染來源人員 在100級潔凈區(qū)或萬級背景下的局部100級潔凈區(qū)。人是無菌藥品生產(chǎn)中的主要污染源，在管理比較到位，生產(chǎn)設(shè)備自動化程度較好，操作人員素質(zhì)較高的企業(yè)，人員操作所致的污染率超過70%。水源性微生物 絕大多數(shù)為革蘭氏陰性菌，不會形成芽孢，不耐熱。其代謝產(chǎn)物及細(xì)胞的尸體及碎片均屬細(xì)胞內(nèi)毒素的污染源空氣中的微生物 基本為革蘭氏陽性菌，有可能會形成芽孢使其耐熱性增大23無菌檢查的局限性無菌的定義理論上：無菌沒有任何活的微生物實(shí)際上：我們無法證明產(chǎn)品中沒有活微生物存在無法對

14、整批產(chǎn)品進(jìn)行100%檢驗(yàn)無菌檢驗(yàn)的結(jié)果只是一個(gè)基于“可能性”的判斷無菌檢驗(yàn)用培養(yǎng)基有其局限性只進(jìn)行細(xì)菌和真菌的檢驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定是基于“是否在培養(yǎng)基中生長”培養(yǎng)條件（如溫度和時(shí)間）是有限的我們的工作環(huán)境及操作是在相對無菌的狀態(tài)24美國非腸道藥物學(xué)會注射劑無菌測試結(jié)果試驗(yàn)?zāi)康模翰缓细竦目赡苄?%)試驗(yàn)批量：60,000支試驗(yàn)方法：按美國藥典無菌測試方法真實(shí)的不合格率測試20支樣品不合格的可能性測試40支樣品不合格的可能性合格結(jié)果的可能性118.2%33.1%?564.2%87.2%?1596.1%99.8%?3099.9%100.0%?25上述無菌測試結(jié)果的啟示含有少量微生物污染產(chǎn)品的批次也有

15、可能“通過”無菌檢驗(yàn)一批產(chǎn)品的染菌率越低，根據(jù)無菌檢驗(yàn)的結(jié)果來判定整批產(chǎn)品的無菌，其風(fēng)險(xiǎn)就越大26如何用無菌檢驗(yàn)來證明整批產(chǎn)品無菌要求有一個(gè)取樣計(jì)劃來涵蓋整個(gè)批號有足夠的取樣量和檢驗(yàn)量選擇適用的培養(yǎng)基采用經(jīng)驗(yàn)證的無菌檢驗(yàn)方法良好的環(huán)境監(jiān)控質(zhì)量問題為何常常未檢出來？27批產(chǎn)品出廠最少檢驗(yàn)數(shù)量供試品批產(chǎn)量N（個(gè)）每種培養(yǎng)基最少檢驗(yàn)數(shù)量注射劑10010%或4個(gè)（取較多者）100N50010個(gè)5002%或20個(gè)（取較少者）大體積注射劑（100 ml）2%或10個(gè)（取較少者）眼用及其他非注射產(chǎn)品2005%或2個(gè)（取較多者）20010個(gè)桶裝固體原料4每個(gè)容器4N5020%或4個(gè)容器（取較大者）502%或1

16、0個(gè)容器（取較大者）28上市抽驗(yàn)樣品（液體制劑）的最少檢驗(yàn)量供試品裝量V(ml)每支樣品接入每管培養(yǎng)基的最少量（ml）最少檢驗(yàn)數(shù)量（瓶或支）1全量 2011V5半量105V2021020V5051050V10010 1050V100(靜脈給藥)半量10100V 500半量6V 500500629上市抽驗(yàn)樣品（固體制劑）的最少檢驗(yàn)量供試品裝量M（mg/支或瓶）每支樣品接入每管培養(yǎng)基的最小量（mg）最少檢驗(yàn)數(shù)量（瓶或支）M 50全量20（1）50M300半量10300M5g15010M5g50010外科用敷料棉花及紗布取100 mg 或1cm3cm10縫合線、一次性醫(yī)用材料整個(gè)材料310帶導(dǎo)管的一

17、次性醫(yī)療器具（如輸液袋）10其它醫(yī)療器具整個(gè)器具3（切碎或拆散開）2030供試品抽驗(yàn)量和檢驗(yàn)量 檢驗(yàn)數(shù)量(對于檢驗(yàn)) 指一次試驗(yàn)所用的供試品最小包裝容器的數(shù)量。 檢驗(yàn)量(對于檢驗(yàn)與驗(yàn)證) 指一次試驗(yàn)所用的供試品總量（g或ml）。每份培養(yǎng)基接種的供試品量。例如:1g規(guī)格的注射用粉針劑 10支 150mg*10表中最少檢驗(yàn)量不包括陽性對照試驗(yàn)的用量。31供試品的處理 目的使供試品分散均勻水溶性供試品固體制劑-內(nèi)酰胺類抗生素供試品非水溶性的供試品膏劑和黏性油劑供試品無菌氣（噴）霧劑供試品裝有藥物的注射器接種含培養(yǎng)基的容器按規(guī)定的溫度培養(yǎng)14天，培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長。32無菌檢測14天

18、補(bǔ)償次佳生長條件考慮到潛在的低生長者修復(fù)受損細(xì)胞全球一體化33陽性對照菌液制備 加菌量為10100cfu 陽性對照管培養(yǎng)4872小時(shí)應(yīng)生長良好。34結(jié)果判斷若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品符合規(guī)定；如在加入供試品后、或在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中或劃線接種于斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌培養(yǎng)2日、真菌培養(yǎng)3日，觀察是否再出現(xiàn)渾濁或斜面有無菌生長；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。若供試品管中任何1管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明試驗(yàn)結(jié)果無效即生長的微生物非供試品所含

19、。35當(dāng)符合下列至少一個(gè)條件時(shí)，方可判試驗(yàn)結(jié)果無效： 無菌檢查試驗(yàn)所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求。 回顧無菌試驗(yàn)過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素。 陰性對照管有菌生長。 供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無菌試驗(yàn)中所使用的物品和（或）無菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的。重試36方法學(xué)研究：驗(yàn)證試驗(yàn)的必要性方法驗(yàn)證：是為檢測方法的可靠性提供重要科學(xué)依據(jù)。微生物檢測的幾個(gè)方面：1、無菌環(huán)境驗(yàn)證（塵埃離子、浮游菌、沉降菌檢測）；2、所有滅菌器具的驗(yàn)證；3、培養(yǎng)基靈敏度檢測；4、陽性代表菌株的選擇等；5、方法的選擇等。2005版藥典與USP、EP、BP國家接軌，將藥品微生物檢查方

20、法的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了，系統(tǒng)化的規(guī)定和要求。并強(qiáng)調(diào)了驗(yàn)證供試品本身對微生物生長的影響。37環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗(yàn)證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷38 驗(yàn)證的目的實(shí)驗(yàn)操作的標(biāo)準(zhǔn)化驗(yàn)證試驗(yàn)的系統(tǒng)化制定標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)謹(jǐn)化最終目標(biāo)：一次檢驗(yàn)即可得到準(zhǔn)確結(jié)果。39方法驗(yàn)證的一般程序與環(huán)節(jié)需前處理不需前處理有抑菌作用無抑菌作用樣品檢查去除抑菌作用驗(yàn)證前處理方法對污染菌生長、檢出的影響。驗(yàn)證抑菌活性去除的有效性，以及去除方法對污染菌生長、檢出的影響?？梢酝ㄟ^驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)判斷40驗(yàn)證什么？前處理去除抑菌作用用到的一切41方法的驗(yàn)證樣品前處理直接接種法薄膜過濾法沖洗量的驗(yàn)證中和劑的驗(yàn)證

21、42無菌檢查驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)： 供試品 直接接種法 薄膜過濾法 100ml/筒 試驗(yàn)組（供試品+菌） 培養(yǎng)基對照組 陽性菌對照組 稀釋劑對照組 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、 （加菌同試驗(yàn)組） 大腸、枯草桿菌、生孢梭菌、 白色念株菌、黑曲霉 規(guī)定T培養(yǎng)35天 觀察結(jié)果 書寫驗(yàn)證報(bào)告 43薄膜過濾法 將規(guī)定量的供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100 cfu的試驗(yàn)菌。取出濾膜接種至相應(yīng)的培養(yǎng)基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。取一支裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量的試驗(yàn)菌，作為陽性對照，按規(guī)定溫度培養(yǎng)35天。各試驗(yàn)菌同法操作。 可少量多次：50-100ml/次；共 次 ，充分振搖，在最后

22、一次無抗菌活性時(shí)加陽性菌100cfu/ml。44直接接種法 取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8支，分別接入金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌的菌懸液1ml(含菌小于100 cfu)各兩管；取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的改良馬丁培養(yǎng)基4管，分別接入白色念珠菌、黑曲霉菌的菌懸液1ml(含菌小于100 cfu)各兩管。其中1管接入規(guī)定量的供試品，另1管作為陽性對照，按規(guī)定的溫度培養(yǎng)35天。45菌落計(jì)數(shù):同時(shí)平皿法液體培養(yǎng)基計(jì)數(shù)46與陽性對照比較，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長良好，則供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無抑菌作用，可按此法進(jìn)行供試品的無菌檢查。如含

23、供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，則供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用，可采用增加沖洗量；增加培養(yǎng)基的用量；使用中和劑如-內(nèi)酰胺酶、對氨基苯甲酸、聚山梨脂80等；更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。 驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的無菌檢查同時(shí)進(jìn)行。47陽性菌株的選擇枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis CMCC（B）63 501金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus CMCC（B）26 003生孢梭菌 Clostridium sporogenes CMCC（B）64 941銅綠假單胞菌 Pseudomonas aerugino

24、sa CMCC（B）10 104大腸埃希菌 Escherichia coli CMCC（B）44 102白色念珠菌 Candida albicans CMCC（F）98 001黑曲霉菌 Aspergillus niger CMCC（F）98 003菌液制備,計(jì)數(shù) 一般當(dāng)日使用48陽性菌株的選擇應(yīng)根據(jù)供試品的特性選擇相應(yīng)的陽性對照菌：無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對照菌；抗真菌的供試品，以白色念珠菌為對照菌。否則會造成誤判!4948小時(shí)細(xì)菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌銅綠假單胞菌大

25、腸埃希菌生孢梭菌沖洗量300ml/桶+酶300萬單位-+-+沖洗量400ml/桶+酶300萬單位+-+沖洗量500ml/桶+酶300萬單位+ +陽性對照+陰性對照-72小時(shí)觀察真菌結(jié)果黑曲霉菌白色念珠菌沖洗量100ml/桶+陽性對照+陰性對照-無抑菌作用、弱抑菌作用的可以從直接過濾不沖洗開始做，但一定要做！50葡萄糖注射液注射用頭孢地嗪注射用克林霉素磷酸酯替硝唑注射液紅霉素軟膏 實(shí)例5個(gè)51無菌檢查原始記錄檢品編號： 第 頁 共 頁 52微生物限度檢查：口服、外用控制項(xiàng)目雜菌數(shù)：細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)?？刂凭ㄖ虏【捍竽c埃希菌、大腸菌群、沙門菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、梭菌。制定原則

26、：非無菌藥品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)是基于藥品的給藥途徑及對患者潛在的危害而制定的。53不含藥材原粉的制劑含藥材原粉的制劑：丸劑含動物藥的制劑：外用制劑：滴眼劑一般局部用藥直腸給藥制劑尿道、陰道給藥制劑滴鼻劑不同制劑的限度54供試品制備液體供試品:10ml固體、半固體或黏稠性供試品10g,勻漿或其它適宜的方法非水溶性供試品具抑菌活性的供試品:培養(yǎng)基稀釋法離心集菌法:500,3000rpm薄膜過濾法中和法;如磺胺類100ml中15ml1%對氨基苯甲酸55供試液制備供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基，不得超過1小時(shí)。供試液制備若需用水浴加溫時(shí)，溫度不應(yīng)超過4556采用稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過濾法、中和法

27、等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性57結(jié)果判斷供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)其中任何一項(xiàng)不符合該品種的規(guī)定，應(yīng)從同一批樣品中隨機(jī)抽樣，獨(dú)立復(fù)試兩次，以3次結(jié)果的平均值報(bào)告菌數(shù)。供試品檢出控制菌或其它致病菌時(shí)，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再復(fù)試。眼用制劑檢出霉菌和酵母菌數(shù)時(shí)，須以兩次復(fù)試結(jié)果均不得長菌，方可判供試品的霉菌和酵母菌數(shù)符合該品種的規(guī)定。若供試品的細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)及控制菌三項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項(xiàng)不符合該品種的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。58微生物限度檢查法驗(yàn)證細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證 定量回收率測定實(shí)驗(yàn)控制菌檢查方法驗(yàn)證 定性

28、能否生長、專屬性實(shí)驗(yàn)59回收率計(jì)算 試驗(yàn)組的菌回收率=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)供試品組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù) 100%稀釋劑對照組的菌回收率=（稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)/菌液組的平均菌落數(shù)）100% 在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對照組、試驗(yàn)組的回收率均不低于70%，若任一次試驗(yàn)中回收率低于70%，應(yīng)重新選擇方法再驗(yàn)證。60方法驗(yàn)證：控制菌控制菌：大腸埃希菌，銅綠假單胞菌，沙門菌，大腸菌群，生孢梭菌計(jì)數(shù)方法：平皿法、薄膜過濾法。特殊：生孢梭菌 （加菌量：10100cfu,只要求生長，不要求回收率）612010版藥典無菌檢查法的主要增修訂情況62增、修訂涉及范圍 前言部分 培養(yǎng)基部分 靈敏度檢

29、查 稀釋液、沖洗液 方法驗(yàn)證 薄膜過濾法 培養(yǎng)及觀察 結(jié)果判斷 表1、表2和表363 前言部分1、新增規(guī)定：“ 防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出?！?、新增規(guī)定：“ 日常檢驗(yàn)還需要對環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控。”3、新增規(guī)定：“ 無菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識，并經(jīng)過無菌技術(shù)的培訓(xùn)。 64干擾物可選用的中和劑或滅活方法 戊二醛酚類、乙醇、吸附物醛類季銨類化合物（QACs）、對羥基苯甲酸酯汞類制劑雙胍類化合物碘酒、洗必泰類鹵化物乙二胺四乙酸（EDTA）磺胺類-內(nèi)酰胺類抗生素亞硫酸氫納稀釋法稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽卵磷脂、聚山梨酯亞硫酸氫納、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽卵磷脂聚山梨酯硫代硫酸鹽鎂或鈣離子對氨基苯甲酸-內(nèi)酰胺酶表1 常見干擾物的中和劑或滅活方法65 培養(yǎng)基靈敏度檢查部分新增加稀釋