分子生物學(xué)檢驗技術(shù)：第八、九、十章 感染性疾病的分子生物學(xué)檢驗（人衛(wèi)3版）

1、感染性疾病的分子生物學(xué)檢驗Molecular diagnosis for infectious diseases感染的慨念 感染是病原體和人體之間的相互作用過程 病原體：衣原體、螺旋體、病毒、細(xì)菌、真菌、原蟲、寄生蟲 病原微生物：致病菌（條件致病菌）微生物人體微生物人體不同的感染狀態(tài)共生狀態(tài)在正常情況下，人體的一些腔道和體表均有微生物寄生 感染后果（轉(zhuǎn)歸） 病原體被清除 - 通過非特異性或特異性免疫隱性感染 - 是感染過程中最常見的類型顯性感染（臨床感染） - 感染致病，慢性感染引起炎癥潛伏性感染潛伏感染期間，病原體一般不排出體外病原攜帶狀態(tài) - 可以沒有臨床癥狀，而能排出病原體帶病原體的種類

2、不同：帶病毒者、帶菌者與帶蟲者不同攜帶狀態(tài) 潛伏期攜帶者、健康攜帶者、急性與慢性攜帶者是很多傳染病的重要傳染源感染性疾病的分子生物學(xué)檢驗策略一般性檢出策略（檢出病原體）：判斷有無感染是何種病原體感染常用方法：PCR 雜交完整性檢出策略：檢出病原體分型（分類）亞型耐藥性常用方法：雜交、PCR、基因芯片、DNA測序感染性疾病分子生物學(xué)檢驗標(biāo)志物病原體核酸分子（DNA/RNA）基因表達(dá)產(chǎn)物代謝物免疫應(yīng)答分子細(xì)胞免疫體液免疫TT致敏T細(xì)胞淋巴因子B漿細(xì)胞IgMIgGIgAIgDIgE感染早期出現(xiàn)臨近恢復(fù)期出現(xiàn)與原蟲和蠕蟲感染有關(guān)定性或定量檢測病原體的核酸，已經(jīng)用于病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染的診斷動態(tài)、定量

3、地檢測病原體核酸，能對療效判斷和病情預(yù)后評價提供客觀的依據(jù)感染性疾病的分子生物學(xué)檢驗臨床價值第一節(jié) 乙肝病毒的分子生物學(xué)檢驗病毒核衣殼（nucleocapsid）包膜（envelope）刺突（spike）核酸（nucleic acid） DNA or RNA衣殼（capsid） 衣殼粒核酸蛋白質(zhì)衣殼乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）全世界有3.5億慢性攜帶者，75%在亞太地區(qū)每年有一百萬人死于HBV感染，是全球范圍內(nèi)第9位死因中國：50%70%的人受過感染，8%12%是HBV攜帶者 世界其它地區(qū)亞太地區(qū)75%75%的長期慢性攜帶者來自亞太地區(qū)HBV在肝細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制A(

4、n)mRNAcccDNAHBsAg 包膜負(fù)鏈DNA包裹后的前基因 mRNA傳染性HBV病毒顆粒傳染性HBV病毒顆粒部分雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶肝 細(xì) 胞HBV基因組結(jié)構(gòu)HBV DNA是帶有部分單鏈區(qū)的環(huán)狀雙鏈DNA分子，是目前已知感染人類最小的DNA病毒?；蚪M長為3.2kb長鏈稱為負(fù)鏈用“L(-)”表示，長度是固定的，它攜帶有病毒全部的編碼信息；短鏈稱為正鏈用“S(+)”表示，S(+)在不同的分子中長度不等，大約是負(fù)鏈的50%100%。粘性末端DR區(qū)域是DNA成環(huán)及病毒復(fù)制的關(guān)鍵區(qū)域HBV基因組負(fù)鏈DNA核苷酸序列上含有6個開放讀碼框架：S、C、P、X 、前-前-S和前-XHBV基因組

5、結(jié)構(gòu)pre-S1 pre-S1 pre-S1蛋白 pre-S2 pre-S2蛋白 S HBsAg（S蛋白） pre-C+C HBeAg C HBcAg（C蛋白） P DNAP（P蛋白） X HBxAg（ X蛋白）編碼HBsAgpre-S2S區(qū) C區(qū) P區(qū) X區(qū) 基因重疊急性感染時期HBV的標(biāo)志物HBV 檢測窗口期血清學(xué)（HBsAg）：56天PCR：33天縮短23天（平均6-15天）普通PCR技術(shù)熒光定量PCR技術(shù)支鏈DNA技術(shù)（核酸探針雜交標(biāo)記信號放大技術(shù)。支鏈DNA（bDNA）是人工合成的帶有許多側(cè)鏈的DNA片段，在每個側(cè)鏈上都可以標(biāo)記可被激發(fā)的標(biāo)志物。檢測時，其靶核酸本身不被擴(kuò)增）核酸雜交

6、技術(shù) 雜交捕獲系統(tǒng) 基因芯片技術(shù)HBV分子生物學(xué)檢驗方法擴(kuò)增位置引物序列擴(kuò)增片段大小(bp)P、X基因特異片段5-ATACTGCGGAACTCCTAGC-32785-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3基因特異片段5-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-34775-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3基因特異片段5-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-32585-ATGGGATCCCTGGATGCTGGGTCTTCCAAA-3HBV DNA檢測（PCR）PCR 引物是PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵，決定擴(kuò)增的特異性和敏感度

7、。PCR引物常根據(jù)其S、C、P和X基因中的高度保守序列來設(shè)計。部分常用的引物序列進(jìn)行HBV DNA檢測的同時使其進(jìn)行相對的量化更直接了解乙肝患者體內(nèi)HBV的復(fù)制及傳染性，能準(zhǔn)確地反映出HBV DNA的復(fù)制水平、病程變化和治療恢復(fù)情況等。其特異性高，靈敏度可達(dá)0.01fg，檢測范圍為2.51022.5109copies/ml。HBV DNA FQ-PCR（real time PCR）乙型肝炎病毒的耐藥性分析最常用的抗HBV藥物為核苷（酸）類似物，如拉米夫定（lamivudine）、阿德福韋（adefovir）耐藥性：HBV的高變異性（逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏嚴(yán)格的校正功能）人體免疫應(yīng)答或疫苗接種等壓力拉米夫

8、定-與dNTP競爭HBV DNAP（逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)）從而抑制復(fù)制起到治療作用。當(dāng)HBV DNAP氨基酸序列發(fā)生改變使HBV DNAP與拉米夫定的結(jié)合能力明顯下降，產(chǎn)生了對拉米夫定的耐藥性。HBV耐藥檢測（ YMDD突變檢測方法）YMDD突變檢測方法1. 基因測序法2. 熒光定量PCR方法基本原理確定探針特定的TM值來區(qū)分是否突變常用方法覆蓋突變位點熒光雙探針雜交 YIDD YMDD YVDD46.91 54.64 50.74HBV 基因分型HBV基因序列差異的多少，可將HBV劃分為不同的基因型，至今為止已發(fā)現(xiàn)A、B、C、D、E、F、G、H共8種基因型：A型主要存在于白人，B型和C型主要存在于亞洲人

9、群E型主要存在于西非F型僅見于中南美洲的土著人G型和H型很少見不同基因型序列長度不同，主要是前S1區(qū)的不同。我國流行的主要是B和C基因型，長江以北以C型為主，長江以南以B型為主，另又少量的A型、D型和混合型。西北和西南尤其是西北有較高比例的D型 PCR-RFLP PCR-RDBELISA基因芯片技術(shù)HBV 的基因分型HBV的分子生物學(xué)檢驗的臨床應(yīng)用早期診斷監(jiān)測治療效果（病毒拷貝數(shù)）判斷病情耐藥檢測第二節(jié) 丙肝病毒的分子生物學(xué)檢驗丙型肝炎病毒（HCV）急性丙肝的臨床診斷1. 流行病學(xué)史：有輸血史、應(yīng)用血液制品史或明確的HCV暴露史。2. 臨床表現(xiàn)：全身乏力、食欲減退、惡心和肝區(qū)疼痛等，其他可有低

10、熱，輕度肝腫大，脾腫大，黃疸。部分患者無明顯癥狀。3. 實驗室檢查：ALT多呈輕度和中度升高，抗-HCV和HCV RNA陽性。約90%的輸血后非甲非乙型肝炎和7080%的無輸血史的散發(fā)型非甲非乙型肝炎由HCV感染所致 HCV血中HCV含量僅為HBV的千分之一HCV的細(xì)胞培養(yǎng)尚未成功，病毒的分離極為困難HCV的變異性很高，使其診斷十分困難HCV的免疫學(xué)標(biāo)志僅有抗HCV一項，且由感染至抗體產(chǎn)生大約需要70天，部分病人感染后始終都不形成抗體 HCV分子生物學(xué)檢驗技術(shù)尤為重要HCV基因組（單鏈RNA）呈球形顆粒直徑約50nm有一脂質(zhì)包膜核心：單股正鏈RNA，全長9.5 kb僅一個開放讀框（ORF），編

11、碼一條含有3010 3033個氨基酸的病毒前體多肽 HCV基因分型的多樣性由于HCV的RNA聚合酶的忠實性不高，所以引起HCV的基因型呈多樣性HCV分為6個（IVI）主要基因型（Simmonds），各型又由若干亞型（a、b、c）組成HCV RNA基因分型有助于判定治療的難易程度及制定抗病毒治療的個體化方案 HCV分子生物學(xué)檢驗HCV RNA定性定性檢測方法：RT-PCRHCV RNA定性檢測的特異度在98%以上，只要一次病毒定性檢測為陽性即可確證HCV感染一次檢測陰性不能完全排除HCV感染，應(yīng)重復(fù)檢查 擴(kuò)增位置引物序列擴(kuò)增片段大小(bp)5端高度保守區(qū)5-GCAGAAAGCGTCTAGCCAT

12、GGCGT-32445-CTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT-35端非編碼區(qū)序列5-GCGACACTCCACCATAGAT-33195-GAATCGTGCTCATGGTGCA-35端非編碼區(qū)序列5-CTGTGAGGAACTACTGTCT-32705-ACTCGCAAGCACCCTATCA-3HCV分子生物學(xué)檢驗HCV RNA定量（病毒載量測定）bDNAreal-time RT-PCR（SOP）1 樣本處理（樣本處理區(qū)）2 擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備（PCR前準(zhǔn)備區(qū)）3 加樣（樣本處理區(qū)） 4 RT-PCR反應(yīng)（檢測區(qū)）HCV基因分型常用方法：測序分析法、RFLP、實時熒光PCR、基因型特異性引物

13、擴(kuò)增法、型特異性核酸探針雜交法及基因分型檢測芯片等 第三節(jié) 人類免疫缺陷病毒的分子生物學(xué)檢驗human immunodeficiency virus（ HIV ） 全國累計報告HIV感染者地理分布 截至2013年9月30日,全國共報告現(xiàn)存艾滋病病毒感染者約43.4萬例HIV在宿主細(xì)胞中的復(fù)制Step 1: BindingStep 2: Reverse TranscriptionStep 3: IntegrationStep 4: ReplicationStep 5: TranslationStep 6: Viral Assembly 靶細(xì)胞：CD4+ T 細(xì)胞HIV基因組基因組為RNA雙分子，

14、與其它逆轉(zhuǎn)錄病毒基本相同其正鏈RNA分子大小為 HIV-1 9.3 kb 有3 組共8個基因 HIV-2 9.7 kb 有3 組共9個基因5端有帽子結(jié)構(gòu)，3端有poly(A)結(jié)構(gòu) HIV基因組第一組：逆轉(zhuǎn)錄病毒共同的結(jié)構(gòu)基因和側(cè)翼末端重復(fù)順序（long terminal repeats） gag（group of antigen)基因：編碼核心蛋白 pol （polymerase）基因：編碼逆轉(zhuǎn)錄酶，DNA聚合酶 env（envelop）基因：編碼包膜蛋白LTRs：不編碼任何蛋白，可起始其它病毒基因的表達(dá)，無種屬特異性第二組：參與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)基因 tat（trans-acting trans

15、criptional gene） rev（regulator of expression of viral protein） nef（negative regulator factor）第三組：負(fù)調(diào)控病毒的感染性，成熟或釋放的基因 vif（viral infectivity factor）vpu（viral protein U） vpr（viral protein R） HIV基因組遺傳變異率高高度變異區(qū)在env基因內(nèi)，相當(dāng)于gp120的五個區(qū)段，gag和pol基因較少變異，是基因組的保守區(qū)域HIV疫苗研發(fā)難度大 HIV-1感染后病毒標(biāo)志物的變化 窗口期：檢測抗體 2-12周檢測p24抗原 2

16、-3周 檢測RNA 11天HIV檢測的分子生物學(xué)檢驗HIV抗體檢測（窗口期測p24抗原，可輔助診斷 ）初篩試驗：酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試紙（金標(biāo)試紙，雙抗原夾心法）最短在感染6天之后就可以檢測到 確認(rèn)試驗：免疫印跡（Western blot, WB）HIV RNA 定性測定方法：RT-PCR基因芯片技術(shù)集合核酸定性檢測原位雜交 HIV病毒載量（HIV RNA 定量）主要有三種技術(shù)：RT-PCR（最低檢測限為50copies/ml ）bDNA（最低檢測限為50copies/ml）NASBA（最低檢測限為20 copies/ml）NASBA（nucleic acid sequence-ba

17、sed amplification）基于核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)PCR檢測前病毒DNA，對出生48h內(nèi)嬰兒的檢測敏感性為38%，出生14d嬰兒的檢測敏感性可為93% 方法檢測范圍實驗內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差（lg）抗凝劑RT-PCR4102-5 0.15 0.33ACD/EDTAbDNA4102-50.08 0.33EDTANASBA4102-50.13 0.33ACD/EDTA/HEP人類免疫缺陷病毒的分型HIV由于高錯誤率的逆轉(zhuǎn)錄酶、病毒的快速復(fù)制、宿主的免疫選擇作用、不同毒株DNA之間的基因重組等原因，其基因具有很高的變異性。目前，HIV分型的方法主要集中在env、gag和pol區(qū)的某一段基因片段的分析。常用方

18、法有：序列分析法、異源雙鏈核酸泳動實驗、限制性片段長短多態(tài)性分析、DNA酶聯(lián)免疫技術(shù)、基因芯片技術(shù)、多重PCR技術(shù)等。人類免疫缺陷病毒的耐藥性分析耐藥是抗病毒藥物作用的病毒基因發(fā)生突變的結(jié)果。HIV快速產(chǎn)生的耐藥是影響治療效果的主要因素。已經(jīng)確定的與6類艾滋病抗病毒藥物耐藥有關(guān)的HIV基因突變有200多個。耐藥性檢測方法種類多，主要集中在耐藥性突變位點的檢測能力和耐藥性突變位點的評價能力。方法：基因芯片耐藥檢測、等位基因探針雜交、寡核苷酸鏈接分析法與直接測序法等。分子生物學(xué)檢驗技術(shù)在很大程度上改變了感染性疾病的診斷方法適用于檢測不能或不易培養(yǎng)、生長緩慢的病原微生物，如結(jié)核分枝桿菌、蒼白螺旋體、病毒等；通過檢測細(xì)菌16SrRNA基因或?qū)ζ錅y序，對細(xì)菌進(jìn)行種屬鑒定，并可能發(fā)現(xiàn)新菌種；進(jìn)行病原體感染的早期診斷，確定感染病原體的類型；通過對