細(xì)胞固定染色法實(shí)驗(yàn)原理及步驟

1、實(shí)驗(yàn)十五 細(xì)胞固定染色法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誋E染色法和Giemsa染色法的原理及染色特征。二、實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)胞固定染色法是用一定的化學(xué)物（固定劑）迅速殺死細(xì)胞，再進(jìn)行染色觀察。固定的目的是使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，脂肪，核糖等轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄晕镔|(zhì)。從而避免自溶及腐敗。經(jīng)過固定的細(xì)胞，在相當(dāng)大的程度上保持了原有的結(jié)構(gòu)，這樣的制版一般能保持很長時(shí)間。我數(shù)固定劑并具有媒染作用，使細(xì)胞容易著色。清楚地顯示細(xì)微結(jié)構(gòu)。固定劑不同，其性能也有差異，一種固定劑對某種結(jié)構(gòu)保存效果好，對別的結(jié)構(gòu)不一定適合，染色劑更是對細(xì)胞內(nèi)的各種化學(xué)成分有不同的親和力。所以每種組織通常有其特定的固定染色方法。本實(shí)驗(yàn)介紹兩種常用的基本染色法。常規(guī)

2、蘇木精-伊紅染色法（HE法）：HE法是組織學(xué)技術(shù)的基本方法，適用于各種組織，各種包埋方式的切片以及培養(yǎng)的組織、細(xì)胞。蘇木精是從蘇木中提取的天然物質(zhì)，是染細(xì)胞核的優(yōu)良染料。而蘇木精對組織親和力很小，不能單獨(dú)使用，需配以氧化劑如高錳酸鉀、過氧化氫、碘酸鈉。等使其脫氫成為蘇木紅；或令其在空氣中自然氧化，并加入帶強(qiáng)正電荷的復(fù)鹽如：鐵明礬、鉻礬、鉀礬等配成混合液使用。在細(xì)胞核染成蘭色之后，用伊紅復(fù)染細(xì)胞質(zhì)。Giemsa染色法：Giemsa染料（細(xì)胞遺傳學(xué)家Gustav Giemsa配成此種染料）不是一種單一的染料，而是數(shù)種染料的混合物，它們是甲基藍(lán)及其氧化產(chǎn)物天青（azure）和伊紅Y。其染色的質(zhì)量隨所

3、用染料的比例不同而異。天青A和天青B都是噻嗪系列的成員，是甲基藍(lán)和重鉻酸鉀一起氧化的產(chǎn)物。天青A是一種堿性染料，分子式是C14H14N3SCl，分子量291。799，它對染色質(zhì)DNA的反應(yīng)與雪夫試劑（Schiff）一樣，實(shí)際上是一種醛反應(yīng)，所以它能使DNA和光華著色，著色的染色體和DNA的色澤明亮。伊紅Y是一種酸性染料，玫瑰紅色，屬噸（xanthene）系列。Giemsa染色液一般是將上述這些粉劑混合物溶解于甘油和甲醇中；經(jīng)染色后，染色質(zhì)呈現(xiàn)紅色，而細(xì)胞質(zhì)為藍(lán)色。三、試劑和器材 方法：試劑：1%NaHCO3水溶液、95%乙醇、無水乙醇、二甲苯、中性樹膠、酸化乙醇分色液（含0。5%濃鹽酸的70乙

4、醇）。FAA固定液：70%乙醇 70ml + 冰醋酸 5ml + 36%甲醛 5mlMayer酸性蘇木精明礬染液：蘇木精 0.5g 銨明礬（NH4）2SO4Al2（SO4）324H2O 0.5gNaIO3 0.1g 甘油30ml 冰醋酸 2ml依次加入70ml蒸餾水中溶解后過濾備用。伊紅染液：伊紅Y 0.5g加水100mlHanks鹽溶液：10母液配制：NaCl 80.0g MgSO47H2O 2.0gKCl 4.0g Na2HPO412H2O 1.2gKH2PO4 0.6g 葡萄糖（無水） 10.0g *CaCl2 1.4g（先單獨(dú)用100ml三蒸水另溶后合并）Hanks工作液配法：取100

5、ml母液+900ml三蒸水1酚紅（單獨(dú)配置）2ml，10磅20分鐘高壓消毒，后用消毒的NaHNO3調(diào)PH至7.07.2.4保存?zhèn)溆?。器材：體外培養(yǎng)細(xì)胞（或各種組織切片）、立式染缸。方法：試劑：甲醇冰醋酸（3：1），現(xiàn)配現(xiàn)用。Giemsa原液：Giemsa色素 1g 甘油 66ml 純甲醇 66ml將Giemsa色素置研缽中用甘油研磨至無顆粒為止，移入55-60水浴內(nèi)2小時(shí)，不時(shí)搖動(dòng)使其溶化，待冷后加入甲醇。貯于棕色瓶內(nèi)。室溫下放置2-3周后，以粗濾紙過濾備用。磷酸鹽緩沖液（pH6.8）：1/15M Na2HPO4 50ml + 1/15M KH2PO4 50ml 器材：培養(yǎng)人外周血細(xì)胞、清潔玻

6、片、吸管、量筒、燒杯、實(shí)驗(yàn)步驟：方法1：本實(shí)驗(yàn)以單層培養(yǎng)細(xì)胞HE染色為例：1、細(xì)胞培養(yǎng)在蓋玻片上，取出后用Hank s液輕輕洗兩遍。2、入FFA液固定15-30分鐘，蒸餾水漂洗。3、入20：1水稀釋的Hayer酸性蘇木精明礬染液浸染10分鐘，自來水沖洗。4、入酸化乙醇至核變紫色。5、入1NaHCO3溶液堿化，漂洗至核呈蘭紫色，自來水沖洗。6、入伊紅染液浸染1分鐘，水洗。7、入95乙醇對伊紅分色，至胞質(zhì)桃紅色。此時(shí)即可做臨床鏡檢。8、如欲做長期保留的標(biāo)本，上述細(xì)胞樣品再入95乙醇，無水乙醇各2分鐘脫水，兩次二甲苯透明，每次5分鐘，滴加中性樹膠，封片。結(jié)果：細(xì)胞核蘭紫色，細(xì)胞質(zhì)桃紅色。方法2：1、細(xì)胞培養(yǎng)在蓋玻片上，取出經(jīng)Hank s液輕輕洗兩次，半小時(shí)入純甲醇固定 5分鐘，或者甲醇冰醋酸（9：1）固定10分鐘，如果著重顯示染色體，則可用甲醇冰醋酸（3：1）反復(fù)固定10分鐘（具體方法見前面的實(shí)驗(yàn)）。充分晾干。2、將Giemsa原液用磷酸緩沖液（1/15M pH6.8）稀釋1020倍，、滴在載玻片上，染色5