重組dna技術(shù)20110413 分子生物學(xué)

1、重組DNA技術(shù)(DNA克隆或分子克隆) DNA Recombination Technique ( DNA Cloning or Molecular Clone) 第二章1944年 O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗:從S型細(xì)菌中分別抽提出DNA、蛋白質(zhì)和莢膜物質(zhì)，并把每一種成分同活的R型細(xì)菌混合，懸浮在合成培養(yǎng)液中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有DNA組分能夠把R型細(xì)菌轉(zhuǎn)變成S型細(xì)菌重組DNA技術(shù)的發(fā)展史O. T. Avery（1944年）證明，遺傳信息的攜帶者是DNA；1953年, Watson和Crick提出了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型1958年,Meselson和Stahl證實了DNA的半保留復(fù)制同年

2、， Crick提出遺傳信息傳遞的“中心法則”1961年， F. Jacob和J. Monod提出了操縱子模型1966年，Nirenberg等人破譯了氨基酸的64個遺傳密碼1972年，P. Berg等率先完成DNA體外重組(諾貝爾化學(xué)獎)1973年，S. Cohen等進(jìn)一步實現(xiàn)了重組DNA的轉(zhuǎn)化1977年 美國南舊金山建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年，第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠。1982年，美國FDA批準(zhǔn)首例基因工程產(chǎn)品-人胰島素1997年 英國羅林研究所成功的克隆了多莉。人體生長激素釋放激素(SS)抑制和調(diào)節(jié)多種激素的作用從動物

3、腦中提取:5mg-50萬只羊腦基因工程9升大腸桿菌 培養(yǎng)液相關(guān)概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因載體基本原理 重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系主要內(nèi)容：第一節(jié)、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念 Concept Associated to Recombinant DNA Technology克隆(clone):是指從一個共同祖先無性繁殖下來的一群遺傳上同一的DNA分子、細(xì)胞或個體所組成的群體獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一） DNA克隆技術(shù)水平：分子克隆(molecular clone) （即DNA 克隆） 細(xì)胞克隆 個體克?。▌游锘蛑参铮┦窃隗w外將不同來源的特異基因或DN

4、A片段插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)建重組DNA分子，然后將重組DNA導(dǎo)入到合適的受體細(xì)胞中，使其在細(xì)胞中擴(kuò)增和繁殖（稱之為“克隆”），篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子(recombinant DNA, chimera DNA） ，即DNA克隆，因此DNA重組技術(shù)又稱為DNA克?。―NA cloning）。DNA克隆生物技術(shù)工程: 基因工程、蛋白質(zhì)工程、酶工程、細(xì)胞工程等 基因工程(genetic engineering) 實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作稱基因工程，又稱重組DNA工藝學(xué)或重組DNA技術(shù)(recombination DNA techni

5、que)，基因操作(gene manipulation)、遺傳工程(genedc engineering)。(二)目的基因進(jìn)行DNA重組的目的主要有兩方面： 分離獲得某一感興趣的基因或DNA 獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）這些使我們感興趣的基因或DNA序列就是目的基因(target DNA)。目的基因有兩種類型： cDNA(complementary DNA):在體外經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的與mRNA互補(bǔ)的DNA?；蚪MDNA(Genomic DNA):代表一個細(xì)胞或生物體整套遺傳信息的所有DNA序列。(三)載體一.表達(dá)載體(expression vector):為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成

6、 多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達(dá)載體。二.克隆載體(Cloning vector):為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。第二節(jié) 重組DNA技術(shù)操作的基本過程基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá) 重組DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為： 分分離目的基因 切限制酶切目的基因與載體接拼接重組體 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞篩篩選重組體 目的基因基因載體重組體分切接轉(zhuǎn)篩表總體技術(shù)路線 以 質(zhì) 粒 為 載 體 的DNA 克 隆 過 程第三節(jié) 重要的工具酶工 具 酶功 能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DN

7、A中相鄰的5磷酸基和3羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA 3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基一.限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease)

8、 限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)是識別DNA的特異序列, 并在識別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H定義：第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：Hin d 屬 系 株 序Haemophilus influenzae d株流感嗜血桿菌d株的第三種酶、（基因工程技術(shù)中常用型）分類： 型限制性核酸內(nèi)切酶的作用特點(diǎn) 回文結(jié)構(gòu)(palindrome) 大部分型限制酶能夠識別由4個8個核苷酸組成的

9、特定序列。型酶識別具有回文結(jié)構(gòu)的核苷酸序列（圖2-2）?！盎匚摹币鉃轫樧x和倒讀都一樣的詞語切口 ：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bst同功異源酶：有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(comp

10、atible end)。Bam HBg l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A 同尾酶名稱 識別序列及切割位點(diǎn)名稱識別序列及切割點(diǎn)切割后產(chǎn)生突出末端:BamH 5GGATCC.3Bgl 5AGATCT.3EcoR 5GAATTC.3Hind 5AAGCTT.3 Hpa 5CCGG.3 Mbo 5GATC.3 Nde 5GATATG.3切割后產(chǎn)生3突出末端:Apa 5GGGCCC.3Hae 5PuGCGCPy.3Kpn 5GGTACC.3Pst 5CTGCAG.3Sph 5GCATGC.3切割后產(chǎn)生平末端:Alu 5A

11、GCT.3EcoR 5GATATC.3Hae 5GGCC.3Pvu 5CAGCTG.3Sma 5CCCGGG.3 限制性內(nèi)切核酸酶二、DNA連接酶(基因工程的“縫紉針”) ： 1. T4噬菌體DNA連接酶：兩個不同片段雙鏈DNA存在互補(bǔ)粘性末端（Km=0.6mol/L)或平末端(Km=50mol/L)。 DNA連接反應(yīng)都是由T4DNA連接酶介導(dǎo) 2. 大腸桿菌DNA連接酶:不能催化平末端DNA分子的連接 三、DNA聚合酶1.大腸桿菌DNA聚合酶I及其大片段(Klenow片段): 大腸桿菌DNA聚合酶I具有三種酶活性。 Klenow片段具有二種酶活性（去除5 3外切酶活性）。2. Taq DNA

12、聚合酶: 耐熱（75-80），分子量65kD,也具5 3外切酶活性。反轉(zhuǎn)錄酶(RDDP):多功能酶，無3 5DNA外切酶活性，具有3 5RNA外切酶活性。工 具 酶功 能限制性核酸內(nèi)切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5磷酸基和3羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA 3末端標(biāo)記等反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA

13、聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基第四節(jié) 常用載體 定義載體是攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞擴(kuò)增和表達(dá)的工具。具備的條件:具有自主復(fù)制能力有多個單一限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)（MCS）具有選擇性遺傳標(biāo)記分子量小拷貝數(shù)高（10個200個/細(xì)胞）具有較高的遺傳穩(wěn)定性。 常用載體:質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNAEcoRSacKpnSmaBamHXbaSalPstSphHind pUC19(2 686bp)AmprLacZ Oriori pUC19質(zhì)粒載體圖 質(zhì)粒 (plasmid):是

14、細(xì)菌內(nèi)攜帶的染色體外的小型雙鏈環(huán)狀DNA，能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制。特點(diǎn): 1.分子量相對較小能在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定存在，能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；有較高的拷貝數(shù)。2.具有一個以上的遺傳標(biāo)志，便于在宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇。3.具有多個限制性酶的單一切口，稱為多克隆位點(diǎn)。便于外源基因的插入。常用質(zhì)粒載體（一） pBR322質(zhì)粒：由一系列大腸桿菌質(zhì)粒DNA通過重組技術(shù)構(gòu)建成，長度為4.36kb，特點(diǎn)：（1）含有復(fù)制起始點(diǎn)和復(fù)制調(diào)節(jié)信號；（2）有單個EcoRI酶切位點(diǎn)，可切開插入目的基因；（3）有抗四環(huán)素基因Ter+和抗氨芐青霉素基因 Amp+，便于重組體細(xì)胞的篩選。1.抗藥性標(biāo)記選擇（二） pUC系列載體:由pBR質(zhì)粒

15、與M13噬菌體構(gòu)建而成，長度為2.674kb，特點(diǎn)：具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。 “藍(lán)白斑”篩選: pUC載體中的LacZ基因可編碼-半乳糖苷酶（-Gal）N端的-肽鏈，該-肽與宿主細(xì)胞(如E.coli JM109）中F因子上的LacZM15基因（-肽缺陷型）的產(chǎn)物互補(bǔ)，產(chǎn)生完整的、有活性的-半乳糖苷酶，分解生色底物（X-gal）形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源基因插入MCS后，LacZ-肽基因的讀碼框被破壞，不能合成完整的-半乳糖苷酶分解底物X-gal，菌落呈白色。稱為“藍(lán)白斑”篩選。EcoRSacKpnSmaBamHXbaSalPstSphHind pUC19(2 686bp)AmprLacZ O

16、riori pUC19質(zhì)粒載體圖 3根據(jù)-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選 :標(biāo)志補(bǔ)救lacZAmN2H片段COOH片段X-galLac Z藍(lán)色化合物X-gal第五節(jié) 目的基因的獲取和體外重組化學(xué)合成法：較短的基因（60-80bp）基因組DNA文庫(genomic DNA library)cDNA文庫(cDNA library)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)一.目的基因的獲取:1.化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列。較短的基因（60-80bp）用途：PCR引物, 測序引物, 定點(diǎn)突變, 核酸雜交探針組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載

17、體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合2.從基因組DNA文庫獲取目的基因基因組DNA(genomic DNA):指代表一個細(xì)胞或生物體整套遺傳信息的所有DNA序列構(gòu)建基因組DNA文庫的基本過程 mRNA cDNA 雙鏈cDNA 重組DNA分子 cDNA文庫 反轉(zhuǎn)錄酶 載體 受體菌 復(fù)制3. 從cDNA文庫獲取目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶A A A A T T T T AAAASI核酸酶 DNA聚合酶堿水解 T T T TcDNA:指經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與RNA (mRNA或病毒RNA)互補(bǔ)的單鏈DNA。以單鏈cDNA為模板

18、、經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈cDNA 基因組文庫和cDNA文庫的比較 PCR技術(shù)的基本過程模板DNA dNTP 引物Buffer預(yù)變性模板DNA dNTP 引物BufferTaqDNA聚合酶循環(huán)儀94oC59455 72 4.PCR技術(shù)獲取目的基因:二.外源基因與載體的連接:體外重組DNA體外重組本質(zhì)上是一個酶促反應(yīng)過程，在DNA連接酶的催化作用下，將外源DNA分子與載體DNA分子連接成一個重組分子的過程。連接方式:（一）黏性末端連接（二）平末端連接（三）同聚物加尾連接（四）人工接頭連接（五）T-A克隆Bam H切割反應(yīng) GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶15CGATCC GGCCTAG+

19、目的基因用 Bam H切割載體DNA用Bam H切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接1.粘性末端連接不同限制酶切位點(diǎn)的連接Eco R切割位點(diǎn)Bg l切割位點(diǎn)+EcoR+ Bg l雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切T4 DNA連接酶15C重組體目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶15C重組體載體自連目的基因 自連2.平端連接 DNA連接酶同聚物尾巴同聚物加尾法連接重組DNA分子 同聚物加尾連接:在末端轉(zhuǎn)移酶的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。利用人工合成的接頭連接重組DNA分子4.人工接頭(linker)連接:由平端加上新的酶

20、切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接5.T-A克隆T-A克隆策略是一種直接將PCR產(chǎn)物插入到載體中的方法。一、重組DNA分子的導(dǎo)入選定的受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件：1. 易于接納重組DNA分子導(dǎo)入；2.對載體的復(fù)制、擴(kuò)增和表達(dá)無嚴(yán)格限制；3.不存在特異性降解外源DNA的酶系統(tǒng)；不對外源DNA進(jìn)行修飾；能表達(dá)重組體分子所提供的某種表型特征。常用的導(dǎo)入方法: （一）轉(zhuǎn)化（transformation）（二）轉(zhuǎn)染（transfection）（三）感染（infection）第六節(jié) 重組DNA分子的導(dǎo)入和篩選與鑒定轉(zhuǎn)化方法：1.氯化鈣法：細(xì)菌處于低溫、低滲CaCl2溶液中，菌細(xì)胞壁通透性增加，菌

21、體膨脹成球形，經(jīng)短暫熱休克后重組DNA易進(jìn)入2.電穿孔法：除特殊儀器外比氯化鈣法更簡單，使用時注意電場強(qiáng)度、電脈沖長度、DNA濃度等參數(shù)。特殊處理受體細(xì)胞細(xì)胞膜特性改變（一）轉(zhuǎn)化（transformation）CaCl2處理受體細(xì)菌50-100mmol/LCaCl2 感受態(tài)細(xì)菌重組體轉(zhuǎn)入細(xì)菌（二）轉(zhuǎn)染 將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程方法：磷酸鈣轉(zhuǎn)染 DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 電穿孔 :操作簡單且轉(zhuǎn)染效率高，幾乎可轉(zhuǎn)染任何細(xì)胞用于瞬時表達(dá)或穩(wěn)定表達(dá)。但是它需要專門儀器，確定最佳實驗條件。 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 :脂質(zhì)體（liposomes）是一種人造類脂膜.用脂質(zhì)體包裹DNA，瞬時表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)，操作簡單，轉(zhuǎn)

22、染效率高，重復(fù)性好，且毒性低、包裝容量大，昂貴。 顯微注射:轉(zhuǎn)染效率高，但需要一定的儀器和操作技巧。主要用于穩(wěn)定表達(dá)（三）感染（infection）感染是指以人工改造的噬菌體或病毒為載體構(gòu)建的重組體DNA，經(jīng)體外包裝成具有感染性的噬菌體顆粒和病毒顆粒后，借助噬菌體或病毒的外殼蛋白將重組DNA注入細(xì)菌或真核細(xì)胞。感染的效率很高，但重組體DNA需經(jīng)過較為復(fù)雜的體外包裝過程。(一）根據(jù)重組載體的遺傳表型進(jìn)行篩選 1根據(jù)載體的抗藥性標(biāo)記篩選 2根據(jù)載體的抗藥性標(biāo)記插入失活選擇3根據(jù)-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選 4根據(jù)插入的外源基因性狀進(jìn)行篩選(二）限制性核酸內(nèi)切酶酶切鑒定（三）核酸分子雜交法（四）PCR法

23、（五）免疫化學(xué)檢測法（六） DNA序列檢測：二.重組體的篩選與鑒定1.抗藥性標(biāo)記選擇AmprTetrBamH位點(diǎn)BamH酶切BamH酶切DNA連接酶目的DNA重組質(zhì)粒大腸桿菌含Amp平板含Amp平板含Tet平板 2.抗藥性標(biāo)記插入失活選擇3根據(jù)-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選 :標(biāo)志補(bǔ)救lacZAmN2H片段COOH片段X-galLac Z藍(lán)色化合物X-gal4根據(jù)插入的外源基因性狀進(jìn)行篩選如把酵母基因組DNA隨機(jī)切割后插入到質(zhì)粒載體中，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到組氨酸缺陷型大腸桿菌細(xì)胞中，并在無組氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。這樣只有含酵母組氨酸基因并獲得表達(dá)的轉(zhuǎn)化菌才能在無組氨酸的培養(yǎng)基中生長。（二）.限制性核酸

24、內(nèi)切酶酶切鑒定凝膠電泳檢測加樣孔DNA Marker空質(zhì)粒重組質(zhì)粒 重組質(zhì)粒酶切重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增片段原位雜交（三）.核酸分子雜交法:菌落雜交篩選法（四）.PCR法某些載體的MCS兩側(cè)存在保守的序列，如pGEM系列載體的MCS兩側(cè)是T7及SP6啟動子序列，可根據(jù)此序列設(shè)計引物，對提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如果已知目的基因的全序列或其兩端的序列與全長，可設(shè)計合成一對引物，以轉(zhuǎn)化菌的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若PCR產(chǎn)物與目的基因的預(yù)期長度相一致，那么即可初步篩選出含重組體的陽性菌落。雞的肌球蛋白的克隆和檢出（五）.免疫化學(xué)檢測法（六）.DNA序列檢測ACTGAAGGCT標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)志

25、，強(qiáng)啟動子 ，翻譯調(diào)控序列，多接頭克隆位點(diǎn)外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)：1融合型表達(dá)蛋白 所謂融合型表達(dá)是指將外源目的基因與另一基因相拼接構(gòu)建成融合基因進(jìn)行表達(dá)。2非融合型表達(dá)蛋白 3分泌型表達(dá)蛋白 利用分泌型表達(dá)載體，需要在信號肽的幫助下進(jìn)行。4包涵體 1. 原核表達(dá)體系第七節(jié) 克隆基因的表達(dá)E.coli表達(dá)體系的不足：不宜表達(dá)真核基因組DNA；不能加工表達(dá)的真核蛋白質(zhì)；表達(dá)的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體(inclusion body) ；很難表達(dá)大量可溶性蛋白 優(yōu)點(diǎn)：可表達(dá)克隆的cDNA及真核基因組DNA 可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì) 表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累 缺點(diǎn)：操作技術(shù)難、費(fèi)時、經(jīng)濟(jì)2.真核表達(dá)體系（

26、酵母、昆蟲、乳類動物細(xì)胞）真核表達(dá)載體大多是穿梭載體, 通常包括以下元件：1啟動子 包括SV40、CMV、RSV及LTR等。2增強(qiáng)子 3剪接信號4終止信號和PolyA化信號5遺傳選擇標(biāo)記 ：胸苷激酶基因（tk）、二氫葉酸還原酶基因（dhfr）、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）、新霉素抗性基因（neor）等。新霉素抗性選擇系統(tǒng) 新霉素的類似物G418（geneticin）對真核和原核細(xì)胞均有毒性。表達(dá)載體中攜帶的neor基因編碼的磷酸轉(zhuǎn)移酶能使G418失活，所以當(dāng)真核細(xì)胞中導(dǎo)入了含neor基因的載體后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞就可以在含有G418的培養(yǎng)基中生長而得以篩選。該選擇系統(tǒng)適用于所有真核細(xì)胞。重組DNA技

27、術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系非常密切并前景遠(yuǎn)大DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective 重組DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn) 品功 能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進(jìn)凝血顆粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落剌激因子剌激白細(xì)胞生成促紅細(xì)胞生成素剌激白細(xì)胞生成生長因子(bFGF, EGF)刺激細(xì)胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些腫瘤白細(xì)胞介素激活、剌激各類白細(xì)胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗(CHO, 酵母)預(yù)防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預(yù)防霍亂重組DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNA cDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交一、A型題：1以質(zhì)粒為載體，將外源基因?qū)胧荏w菌的過程稱為： A轉(zhuǎn)化 B轉(zhuǎn)染 C轉(zhuǎn)導(dǎo) D轉(zhuǎn)位 E感染2最常用的篩選轉(zhuǎn)化細(xì)菌是否含有質(zhì)粒的方法是： A營養(yǎng)互補(bǔ)篩選 B抗藥性篩選 C免疫化學(xué)篩選 D原位雜交篩選 ESouthern印跡篩選3.互補(bǔ)篩選屬于： A抗藥性標(biāo)志篩