玻璃體內(nèi)注射谷氨酸導(dǎo)致大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞內(nèi)ERK12磷酸化水

1、玻璃體內(nèi)注射谷氨酸導(dǎo)致大鼠視網(wǎng)膜Mller細(xì)胞內(nèi)ERK1/2磷酸化水周潤海嚴(yán)宏段小莉王百忍【關(guān)鍵詞】谷氨酸nIntravitrealglutaateinjetininduesaninreasedphsphrylatinfERK1/2inretinalllerellsfrats【Keyrds】glutaiaid;retinalllerells;ERK1/2【摘要】目的：不雅察大鼠玻璃體內(nèi)注射谷氨酸后視網(wǎng)膜ller細(xì)胞內(nèi)ERK1/2分子的磷酸化程度，為探究ERK1/2通路的激活在谷氨酸毒性損傷視網(wǎng)膜時的庇護(hù)作用提供形態(tài)學(xué)證據(jù).要領(lǐng)：SD大鼠18只，隨機(jī)分為生理鹽水比較組、谷氨酸注射后3d組和7d組

2、，每組6只.隨機(jī)拔取大鼠的一只眼舉行玻璃體內(nèi)注射，實行組注射谷氨酸(375nl)2L，比較組注射等量生理鹽水，注射后3或7d后，取出眼球作冰凍切片，接納免疫組化法表現(xiàn)視網(wǎng)膜中的含磷酸化ERK1/2的陽性布局，用圖像闡發(fā)比力比較組和差異實行組的均勻灰度值.效果：注射谷氨酸7d組的視網(wǎng)膜ller細(xì)胞內(nèi)ERK1/2表達(dá)上調(diào)，其灰度值9700221比比較組灰度值12800323和注射谷氨酸3d組的灰度值12600412均低P005，與這兩組的灰度值之間差異有明顯性.結(jié)論：玻璃體內(nèi)注射谷氨酸導(dǎo)致大鼠視網(wǎng)膜ller細(xì)胞激活，ERK1/2磷酸化程度增高，ERK1/2通路的激活大概在視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞受到快樂性毒性

3、損傷時起到緊張的庇護(hù)作用.【關(guān)鍵詞】谷氨酸；視網(wǎng)膜ller細(xì)胞；ERK1/20弁言如今很多研究表白青光眼患者視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞RGs凋亡是由于高眼壓所致的機(jī)器性損害和谷氨酸增多的化學(xué)性毒性作用.谷氨酸是視網(wǎng)膜的構(gòu)成身分之一，是感光細(xì)胞、雙極細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的重要神經(jīng)遞質(zhì).但谷氨酸濃度過高時，會使其受體超快樂，對神經(jīng)細(xì)胞有顯著的毒性作用，引起神經(jīng)元的損傷和凋亡1.ERK1/2(extraellularsignalregulatedkinases,ERK1/2)，是APK家屬的緊張成員之一，對絲裂素、激素、快樂性毒素等生理刺激和病理刺激均可作出差異的反響，操縱著細(xì)胞的順應(yīng)、增殖、分化、存活和凋亡的生理歷

4、程2.Siger等證實，雌激素可通過APK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活造就的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的ERK1/2通路，對抗谷氨酸誘導(dǎo)的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的凋亡，但如今尚缺乏在體的證據(jù).本研究于在體動物，不雅察了玻璃體內(nèi)注射谷氨酸后視網(wǎng)膜ller細(xì)胞內(nèi)ERK1/2分子的磷酸化程度，為探究ERK1/2通路的激活在谷氨酸毒性損傷視網(wǎng)膜時的庇護(hù)作用提供形態(tài)學(xué)證據(jù).1質(zhì)料和要領(lǐng)11實行動物和分組選擇18只SD大鼠第四軍醫(yī)大學(xué)實行動物中央提供，體質(zhì)量200250g，無眼疾，牝牡不拘.豢養(yǎng)情況：光照時間6A6P，光照強(qiáng)度330lux，室溫21.隨機(jī)分為生理鹽水比較組、谷氨酸注射后3d組和7d組，每組6只.12谷氨酸注射模子的創(chuàng)立用

5、10/戊巴比妥鈉按50/kg行ip麻醉,用5/丁卡因點眼2次行眼表麻醉，用10L的微量注射器上海醫(yī)用激光儀器廠經(jīng)顳側(cè)鞏膜刺入玻璃體內(nèi)，處置懲罰組玻璃體內(nèi)注射375nl的谷氨酸美國Siga公司，粉劑用生理鹽水溶解2L3，比較組眼內(nèi)注射生理鹽水2L.13標(biāo)本結(jié)實和切片每組模子建好后，動物成活3或7d，然后用10g/L戊巴比妥鈉80g/kg行ip麻醉，麻醉后開胸,經(jīng)心臟用100L生理鹽水和40g/L多聚甲醛(pH74)結(jié)實液500L灌注,取出眼球,用200g/L蔗糖溶液后結(jié)實.將眼球用TissuTek包埋,在20的冰凍切片機(jī)內(nèi)做眼球矢狀冰凍切片，片厚16.切片在20收藏.14免疫構(gòu)造化學(xué)染色接納免疫

6、組化AB染色法.10l/LPBS漂洗5in3次；30g/LH22關(guān)閉30in；10g/L牛血明凈卵白和30L/L正常羊血清在室溫別離孵育切片20in；切片浸入3L/LTritn100約莫5in；兔抗pERK1/2抗體11000,Siga公司室溫下孵育切片24h；生物素化的羊抗兔IgG1500,Vetr公司室溫下孵育4h；生物素辣根過氧化物酶復(fù)合物AB,1500Vetr公司室溫孵育2h；硫酸鎳銨加強(qiáng)DAB藍(lán)色反響呈色，當(dāng)陽性產(chǎn)物呈深藍(lán)色而背底險些無色時停頓反響,貼片,脫水、透明、封片，光鏡下不雅察并照相.15圖像闡發(fā)接納Quantieent570圖像闡發(fā)儀，放大倍數(shù)為40，用Qui圖像闡發(fā)軟件測

7、得視網(wǎng)膜免疫反響強(qiáng)度均勻灰度，染色越深灰度值越小，最黑為0，每個切片隨機(jī)選擇3個視野，測定陽性細(xì)胞的灰度值，以均勻值作為斷定該大鼠視網(wǎng)膜上的pERK表達(dá)程度的尺度.統(tǒng)計學(xué)處置懲罰3組均數(shù)比力用方差闡發(fā)，均數(shù)間多重比力用LSDt查驗.設(shè)明顯性水準(zhǔn)=005.統(tǒng)計闡發(fā)接納SPSS110軟件完成.2效果21免疫組化效果pERK在各組動物視網(wǎng)膜均有表達(dá)，注射谷氨酸后7d組表達(dá)最強(qiáng)，比較組表達(dá)最弱，注射谷氨酸后3d組介于兩者之間.比較組pERK陽性產(chǎn)物只見于內(nèi)核層和節(jié)細(xì)胞層，只標(biāo)識表記標(biāo)幟了部門細(xì)胞突起，很少見陽性的細(xì)胞胞體Fig1A；注射谷氨酸7d組pERK的表達(dá)加強(qiáng)，不但在內(nèi)核層和節(jié)細(xì)胞層有很強(qiáng)的表達(dá)

8、，在外叢狀層和外界膜、內(nèi)界膜ller細(xì)胞的突起也有很強(qiáng)的表達(dá)，陽性標(biāo)識表記標(biāo)幟的突起稠密而勻稱，內(nèi)核層可見有少量的胞體陽性著色，有部門地區(qū)可以看到陽性表達(dá)的細(xì)胞胞體和突起貫串視網(wǎng)膜全層Fig1B；注射谷氨酸3d組和比較組根本同等，僅范圍在節(jié)細(xì)胞和內(nèi)核層Fig1.按照這些陽性細(xì)胞染色布局特性以及陽性著色的放射狀突起從內(nèi)界膜縱穿外界膜的特點，我們可以推斷出ERK陽性細(xì)胞是視網(wǎng)膜ller細(xì)胞.圖1視網(wǎng)膜Phsp-ERK1/2免疫組化染色略22圖像闡發(fā)效果經(jīng)LSDt查驗，注射谷氨酸7d組的灰度值9700221與比較組的灰度值12800323和注射谷氨酸3d組的灰度值12600412之間均有差異7d組與

9、比較組P1=0024,7d組與3d組P2=0031.比較組與注射谷氨酸3d組間無差異P=0083.3討論本研究創(chuàng)造，在正常狀態(tài)時，僅在視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層有少量的pERK1/2的陽性表達(dá)，當(dāng)玻璃體內(nèi)注射谷氨酸3d后，在視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)叢狀層ERK1/2通路激活略有增長，而在注射谷氨酸7d后，視網(wǎng)膜的pERK通路大量激活，按照陽性細(xì)胞胞核和放射狀突起縱穿視網(wǎng)膜的的特性性布局和其位于內(nèi)核層的位置特點可以確定激活的細(xì)胞重要為ller細(xì)胞，其增殖的細(xì)胞胞體胖大，細(xì)胞突起稠密而勻稱，部門伸出的突起達(dá)外叢狀層、外界膜和內(nèi)界膜，乃至縱穿視網(wǎng)膜全層.ller細(xì)胞在視網(wǎng)膜內(nèi)起支架作用，胞體位于內(nèi)核層，伸出放射狀粗細(xì)

10、差異的突起縱穿視網(wǎng)膜，形成了視網(wǎng)膜的內(nèi)、外界膜，對維持細(xì)胞外和玻璃體內(nèi)的谷氨酸程度起著緊張的作用4,5.通常谷氨酸被ller細(xì)胞敏捷從細(xì)胞間質(zhì)運(yùn)走，在細(xì)胞內(nèi)再轉(zhuǎn)化成谷氨酰胺，通過谷氨酸/谷氨酰胺循環(huán)又以谷氨酸情勢開釋于突觸間隙發(fā)揮快樂性神經(jīng)遞質(zhì)的成效.在玻璃體內(nèi)注射谷氨酸后，視網(wǎng)膜細(xì)胞外的谷氨酸凌駕正常生理濃度，對神經(jīng)元產(chǎn)生了毒性作用，機(jī)體通過自我庇護(hù)和修復(fù)機(jī)制，激活了大量的ller細(xì)胞來掃除過量的谷氨酸，同時由于谷氨酸的毒性刺激導(dǎo)致ller細(xì)胞的ERK1/2的磷酸化程度上調(diào).由此可見，ller細(xì)胞對視網(wǎng)膜神經(jīng)元受到谷氨酸毒性損傷后的庇護(hù)作用有部門大概是通過ERK通路的激活來完成的.Rth等6

11、創(chuàng)造視網(wǎng)膜缺血6h后ller細(xì)胞的ERK表達(dá)增長，利用其按捺劑PD98059后，內(nèi)核層變薄，RGs凋亡增長，表白ERK的激活對視網(wǎng)膜缺血有神經(jīng)庇護(hù)作用.rike等7研究創(chuàng)造大腦受到損害性刺激后，星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的ERK1/2通路的激活可以按捺神經(jīng)元的凋亡，促進(jìn)神經(jīng)元的存活，阻斷ERK通路后，神經(jīng)元的凋亡率明顯增長，可見在大腦ERK通路的激活也起到了神經(jīng)庇護(hù)作用；聶亞雄8等研究創(chuàng)造腦溢安含藥血清能上調(diào)谷氨酸損傷后的大鼠海馬神經(jīng)元的ERK程度，其按捺劑能阻斷腦溢安對神經(jīng)元的庇護(hù)作用；通過上述研究結(jié)論結(jié)合本實行效果，我們可以推測玻璃體內(nèi)注射谷氨酸后，一方面，機(jī)體通過自身庇護(hù)機(jī)制調(diào)治大量視網(wǎng)膜ll

12、er細(xì)胞激活，掃除過量的谷氨酸；另一方面谷氨酸毒性刺激使得ller細(xì)胞上的ERK通路的激活,既可以直接按捺神經(jīng)元的凋亡，又可以將細(xì)胞外生長、分化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核，啟動核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，從而促進(jìn)ller細(xì)胞進(jìn)一步的增殖和分化，為神經(jīng)節(jié)細(xì)胞提供更多緊張的營養(yǎng)物質(zhì)和有利的保存情況，按捺神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡.本實行通過對在體谷氨酸毒性損傷時視網(wǎng)膜ERK信號通路的研究，為青光眼視神經(jīng)庇護(hù)治療提供了一個新思緒.【參考文獻(xiàn)】1alzadaJI,JnesBE,NetlandPA,etal.GlutaatEinduedexittxiityinretina:Neurprtetinithreeptrantagnist,de

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