pd2.2-lfq tutorial非標記定量無需在中選擇方法可直接GroupingQua

1、非標記定量分析流程定量實驗設計01以對四個文件進行非標記定量為例:非標記定量無需在 Study Defination 中選擇定量方法，可直接在Grou頁面選擇定量組別(如不同的文件)生成對應的比值。&fication每個實驗組有多個重復時，可通過 study factor 歸類，生成各個實驗組的 ratio。在 sles頁面可設置各個樣品的類別。在 Grou&fication 中生成 ratio。非標定量樣品有多個餾分時，可通過 fraction number 歸類。feature mapper 節(jié)點會自動識別，只在同一個 fraction number 的樣品間進行 map。非標記定量分析流

2、程數(shù)據(jù)分析模板02Prosing workflow: 可使用 PD2.2 內置模板Common TemplatesProsingWF_QexactivePWF_QE_Precursor_Quan_and_LFQ_SequestHT_PercolatorSpecturm Files RC: 對質量進行recalibration, 可提高feature map的效果，在LFQ中使用，其原理為進行一次快速的搜庫，因此參數(shù)設置可參考搜庫節(jié)點(如Sequest HT)中的設置。Minora Feature Detector: 提取色譜中的MS1峰特征。通常使用默認的提取參數(shù)即可。Consensus wo

3、rkflow: 可使用 PD2.2內置模板Common TemplatesConsensusWFprehensive_Enhanced Annoion_LFQ_and_Precursor_Quan.pdConsensusWFFeature Mapper: 在不同的文件中對比色譜峰，可減少定量的缺失值。通常使用默認參數(shù)。Precursor Ions具體設置見下頁。fier: 非標記定量節(jié)點。參數(shù)非標記定量分析流程節(jié)點參數(shù)設置031. 定量通用設置：a）用于定量的肽段：大多數(shù)利用 Unique peptide 和 Razor peptide 做定量；b）對于 Unique peptide 要考慮是

4、否專屬于一個 protein group，默認為 True；c）是否帶有 missing channel 的定量結果，默認 False；2. 母離子定量設置： a）可使用ensity 或 Area 進行母離子定量，使用ensity；b）可設置肽段的色譜峰特征至少要在一定比例（0-100）的樣品中被檢測到，低于設置值的肽段將不參與蛋白定量；定量結果的歸一化與標尺化：a）是否使用歸一化對結果進行校正，一般可以使用“Total Peptide Amount”進行歸一化校正，如果理論混合比例不為 1，無需歸一化校正，可以選擇“None”；“RT Dependent”可在不同保留時間范圍采用不同的校正參

5、數(shù)，在發(fā)現(xiàn)樣品噴霧不穩(wěn)定等情況時采用；b）僅當“Normalization Mode”設置為“Specific Protein Amount”時使用，指定特定的 FASTA 數(shù)據(jù)庫作為看家蛋白用于歸一化，該 FASTA 文件需要預先添加；c）對定量結果進行標尺化，有利于結果的熱圖展示，可以選擇 “On Channels Average （Per File）”，保證每個文件中每個蛋白和肽段所有 channel 的平均值都為 100，當選擇“On Control Channels Avg. （Per File）”時，保證每個文件中每個蛋白和肽段的control channel 的平均值都為 100

6、。不參與蛋白定量的肽段修飾：PD可在定量蛋白時，排除發(fā)生某些特定翻譯后修飾修飾的肽段（如氧化的肽段）5. 蛋白比值計算及假設檢驗：對于非標記定量，使用 Pairwise Ratio Based +ANOVA (Background Based)。各參數(shù)具體含義：a）計算蛋白比值的方法：Pairwise Ratio Based，所有有效的多肽比值的中位數(shù)（注：此時定量 ratio 不可傳遞計算，如希望計算 a/b, b/c, a/c 的比值，應在定量頁面直接生成全部三個 ratio 值）；b）允許最大的差異倍數(shù)，默認 100；c）是否進行缺失值填充，默認為 None（不進行缺失值填充）；d）假設

7、檢驗：可進行基于蛋白背景變化或單個蛋白變化的 p 值計算（需有重復實驗才能計算單個蛋白變化的 p 值。注： 在使用 pairwise ratio based 定量時，不能計算單個蛋白變化的p值）；6. PD 用不同的顏色強調不同的變化倍數(shù)，變化倍數(shù)可自行定義（如下圖展示）：非標記定量分析流程結果展示04結果展示：分析完成后即可在結果的 Proteins 頁面的 Abundance Ratios 列查看蛋白變化倍數(shù)如想了解蛋白中每個肽段的定量比值，可在 Peptide Group 頁面查看數(shù)據(jù)時，可點擊chromatogram trace view查看肽段對應的色譜峰。還可從每個肽段的 Assoted Tables 中選擇對應的 Consensus Features 查看色譜峰的具體信息，如不