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文檔簡介

1、關(guān)于細菌內(nèi)毒素檢查PPT第一張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6月實驗原理利用鱟試劑與微量內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的現(xiàn)象,以判斷供試品中細菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。陽性結(jié)果細菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位(EU)表示。第二張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6月實驗試劑鱟試劑 從海洋無脊椎動物“鱟”的藍色血液中提取的變形細胞溶解物,經(jīng)低溫冷凍干燥精制而成的生物制劑。 鱟試劑的生物活性以其能檢出細菌內(nèi)毒素的最低有效濃度表示,即鱟試劑的靈敏度,單位為EU/ml。當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生可能影響檢驗結(jié)果的改變時,應(yīng)進行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗。第三張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6

2、月實驗試劑細菌內(nèi)毒素國家標準品 系自大腸埃希菌提取精制得到的內(nèi)毒素,用于標定細菌內(nèi)毒素工作標準品和標定,仲裁鱟試劑靈敏度。細菌內(nèi)毒素工作標準品 系以細菌內(nèi)毒素國家標準品為基準標定其效價,用于試驗中鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗及各種陽性對照。細菌內(nèi)毒素檢查用水 指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml(用于凝膠法)或0.005EU/ml(用于光度測定法)且對內(nèi)毒素試驗無干擾作用的滅菌注射用水。第四張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6月試驗器具 刻度吸管、凝集管(1075mm)、三角瓶、小試管(16100mm)、試管架、洗耳球、封口膜或金屬試管帽、時鐘、脫脂棉、吸水紙、剪刀砂輪。耐熱器皿常用干熱滅菌

3、法(250、30 分鐘以上)去除,塑料用具應(yīng)選用標明無內(nèi)毒素并且對試驗無干擾的器械(目前多為無熱原的一次性用品 )。第五張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6月檢查方法概述凝膠法 限量試驗 半定量試驗光度測定法 濁度法(終點濁度法和動態(tài)濁度法) 顯色基質(zhì)法(終點顯色法和動態(tài)顯色法) 凝膠法:最簡單、經(jīng)濟、應(yīng)用最廣泛,中國藥典的“仲裁”方法 對干擾相對不敏感。 較光度測定法不靈敏第六張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6月供試品溶液的制備 某些供試品需進行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的pH 值在6.08.0 的范圍內(nèi)??墒褂盟?、堿溶液或適宜的緩沖液調(diào)節(jié)pH

4、值。第七張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6月內(nèi)毒素限值的確定一般按公式:L=K/M 式中 L 為供試品的細菌內(nèi)毒素限值,以EU/ml、EU/mg 或EU/U(活性單位)表示。 K 為人每公斤體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量。注射劑K=5EU/(kgh),放射性藥品注射劑K=2.5EU/(kgh),鞘內(nèi)用注射劑K=0.2EU/(kgh)。 M 為人用每公斤體重每小時的最大供試品劑量,依據(jù)藥品使用說明書,臨床用藥須知確定。例:某產(chǎn)品M為14.3mg/kg,L=5/14.3=0.35EU/mg 假如此產(chǎn)品的濃度為100mg/ml,那么, L=0.35100=35EU/ml第八張,PPT共二十九

5、頁,創(chuàng)作于2022年6月最大有效稀釋倍數(shù)的確定 最大有效稀釋倍數(shù)(MVD) 指在試驗中供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù),在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進行內(nèi)毒素限值的檢測。MVD=cL/ 式中L 為供試品的細菌內(nèi)毒素限值;c 為供試品溶液的濃度,當L 以EU/ml 表示時,則c 等于1.0ml/ml,當L以EU/mg 或EU/U 表示時,c 的單位需為mg/ml 或U/ml。如供試品為注射用無菌粉末或原料藥,則MVD 取1,可計算供試品的最小有效稀釋濃度c=/L;為在凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度(EU/ml)。第九張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6月鱟試劑靈敏度復(fù)核目的 考察鱟試劑的靈敏度是否準

6、確、考察檢驗人員操作方法是否正確及實驗條件是否符合規(guī)定。 當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發(fā)生可能影響檢驗結(jié)果的改變時,應(yīng)進行鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗。細菌內(nèi)毒素標準溶液的準備 1、取細菌內(nèi)毒素工作標準品(或國家標準品)一支,輕彈瓶壁,使粉末落入瓶底,然后用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕,75%酒精棉球擦拭后啟開,啟開過程中應(yīng)防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。 第十張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6月鱟試劑靈敏度復(fù)核 2、按照標準品說明書,加入規(guī)定量的細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物,用封口膜將瓶口封嚴,置漩渦混合器上混合15分鐘。然后進行稀釋,制備成4個濃度的細菌內(nèi)毒素標準溶液,即 2、0.5和0.25(為所復(fù)核的

7、鱟試劑的標示靈敏度)四個濃度的內(nèi)毒素標準溶液,每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30 秒鐘。示例 某待復(fù)核鱟試劑的靈敏度標示值為0.25EU/ml,細菌內(nèi)毒素工作標準品規(guī)格為150 EU/ml,將細菌內(nèi)毒素工作標準品用1ml細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解,再稀釋制備成濃度為0.50 EU/ml,0.25EU/ml,0.125EU/ml和0.06EU/ml的細菌內(nèi)毒素標準溶液。 第十一張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6月鱟試劑靈敏度復(fù)核細菌內(nèi)毒素標準溶液的制備圖示:第十二張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6月鱟試劑靈敏度復(fù)核待復(fù)核鱟試劑的準備 取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑18支,每支加入0.1

8、ml檢查用水使溶解備用(規(guī)格大于 0.1ml支的鱟試劑,按其標示量加入細菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶后按0.1ml/管分裝到凝聚管中,至少準備18管)。加樣 將已充分溶解的待復(fù)核鱟試劑18支(管)放在試管架上,排成5列,其中4列4支,1列2支。其中4支4列分別加入0.1ml的2、0.5和0.25的內(nèi)毒素標準溶液;另2支(管)加入0.1ml檢查用水作為陰性對照。第十三張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6月鱟試劑靈敏度復(fù)核 加樣結(jié)束后,將鱟試劑用封口膜封口,輕輕振動混勻,垂直放入371恒溫器中,保溫602分鐘。結(jié)果觀察 將試管輕輕取出,緩緩倒轉(zhuǎn)180,若管內(nèi)形成凝膠,并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽

9、性,未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫者為陰性。陽性陰性第十四張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6月鱟試劑靈敏度復(fù)核計算 當最大濃度2管均為陽性,最低濃度0.25管均為陰性,陰性對照為陰性時實驗為有效,按下式計算反應(yīng)終點濃度的幾何平均值即為鱟試劑靈敏度的復(fù)核結(jié)果。 c=lg-1(X/4) 式中 X 為反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值(lg)。 反應(yīng)終點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度。 第十五張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6月鱟試劑靈敏度復(fù)核例子:結(jié)果判斷 當c 在0.52(包括0.5和2)時,方可用于細菌內(nèi)毒素檢查,并以標示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度。第十六

10、張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6月干擾實驗 目的 確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)不存在干擾作用,為能否使用細菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。當進行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗前,或無內(nèi)毒素檢查項的品種建立內(nèi)毒素檢查法時,須進行干擾試驗。當鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時,須進行干擾試驗。 第十七張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6月干擾實驗進行干擾試驗一般步驟 供試品限值確定 根據(jù)鱟試劑的靈敏度確定MVD范圍(供試品溶液濃度范圍) 預(yù)試驗(初篩試驗)確定樣品最大不干擾濃度 正式干擾試驗干擾實驗預(yù)實驗 目的 初步確定供試品的

11、最大不干擾濃度(當限值以EU/mg或EU/U活性單位表示)或最小不干擾稀釋倍數(shù)(當限值以EU/ml表示),為正式干擾實驗提供依據(jù),避免干擾試驗的盲目性。 第十八張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6月干擾實驗操作方法 1、將無可檢測到內(nèi)毒素的供試品進行一系列倍數(shù)的稀釋,但最大的稀釋倍數(shù)不得超過MVD=CL/0.03(0.03EU/ml為現(xiàn)今我國市售鱟試劑的最高靈敏度)。 2、使用鱟試劑對每一稀釋倍數(shù)進行檢驗。每一稀釋倍數(shù)下做2支供試品管和2支供試品陽性對照(即該濃度的供試品稀釋液將內(nèi)毒素標準品制成2濃度)。另取2支細菌內(nèi)毒素檢查用水作陰性對照,2支加入2濃度的內(nèi)毒素標準溶液作為陽性對照。 例

12、 制備稀釋倍數(shù)為4的供試品陽性對照溶液:0.3ml4.0EU/ml的內(nèi)毒素標準液+0.3ml稀釋倍數(shù)為2的供試品稀釋液0.6ml含2EU/ml內(nèi)毒素標準液的稀釋倍數(shù)為4的供試品稀釋液 3、保溫602分鐘,觀察并記錄結(jié)果。第十九張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6月干擾實驗 4、當陰性對照為陰性,陽性對照為陽性時,實驗有效。當系列濃度中出現(xiàn)供試品溶液2管為陰性,供試品陽性對照2管為陽性時,認為供試品在該濃度下不干擾實驗,此稀釋倍數(shù)即為最小不干擾稀釋倍數(shù)。即可選擇該稀釋倍數(shù)進行正式干擾實驗。 5、當系列濃度中所有濃度的供試品管都不為陰性,或供試品陽性對照不為陽性時,說明供試品對內(nèi)毒素與鱟試劑的

13、反應(yīng)存在干擾,則應(yīng)對供試品進行更大稀釋倍數(shù)(不得超過MVD=CL/0.03 ),或通過其他適宜的方法(如過濾、中和、透析或加熱處理等)排除干擾。 6、當供試品的內(nèi)毒素限值單位為EU/mg或EU/U活性單位時,應(yīng)將最小不干擾稀釋倍數(shù)換算成最大不干擾濃度(即稀釋倍數(shù)下溶液的濃度),以mg/ml或活性單位/ml表示。 第二十張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6月干擾實驗舉例 某注射液限值為2.5EU/ml,按MVDCL/計算出靈敏度為0.03EU/ml下的MVD為83倍,將供試品溶液進行一系列稀釋,用靈敏度為0.25 EU/ml的鱟試劑預(yù)實驗,結(jié)果如下:稀釋倍數(shù)原液510204080供試品溶液

14、供試品陽性對照 + + + +由以上結(jié)果可初步確定該樣品的最小不干擾稀釋倍數(shù)為20倍,可在此濃度下進行正式干擾試驗。第二十一張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6月干擾實驗正式干擾實驗 制備內(nèi)毒素標準對照溶液 取1支細菌內(nèi)毒素標準品,用細菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成4個濃度的標準溶液即2、0.5、0.25。 制備含內(nèi)毒素的供試品溶液 將供試品稀釋至預(yù)實驗中確定的不干擾稀釋倍數(shù),再用此稀釋液將同支細菌內(nèi)毒素標準品稀釋成4個濃度即2、0.5、0.25的含內(nèi)毒素的供試品溶液。 鱟試劑的準備 取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑36支,備用。 第二十二張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6月干擾實驗 加樣 準

15、備好的36支鱟試劑放在試管架上,按下圖加樣。0.1ml內(nèi)毒素標準液0.1ml檢查用水0.1ml含內(nèi)毒素的供試品液0.1ml供試品液加樣結(jié)束后,用封口膜封口,輕輕振動混勻,避免產(chǎn)生氣泡,放入371恒溫器中,保溫602分鐘,觀察并記錄結(jié)果。第二十三張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6月干擾實驗 實驗結(jié)果計算 如兩組最大濃度2.0均為陽性,最低濃度0.25均為陰性,陰性對照4管均為陰性時,按下式計算用檢查用水制成的內(nèi)毒素標準溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值(Es)和用供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值(Et)。Es=lg-1(Xs/4)Et=lg-1(Xt/4) 式中 X

16、s、Xt 分別為用檢查用水和供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值(lg)。第二十四張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6月干擾實驗 當Es 在0.52(包括0.和2)及Et 在0.5Es2Es(包括0.5Es和2Es)時,則認為供試品在該濃度下無干擾作用,可在該濃度下對此供試品進行細菌內(nèi)毒素檢查。 當Et不在0.5Es2Es(包括0.5Es和2Es)時,則認為供試品在該濃度下干擾實驗。應(yīng)使用適宜方法排除干擾,如可將供試品進行更大倍數(shù)稀釋(不超過MVD )。 建立新品種細菌內(nèi)毒素檢查方法時,每個廠家至少取三個批號的供試品。用兩個以上鱟試劑生產(chǎn)廠家的鱟試劑進行干擾實驗。第二十

17、五張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6月供試品細菌內(nèi)毒素檢查在細菌內(nèi)毒素檢查中,每批供試品必須做2支供試品管和2支供試品陽性對照,同時每次實驗必須做2支陽性對照和2支陰性對照。供試品溶液的制備 根據(jù)內(nèi)毒素限度值,計算MVD=CL/。然后將供試品進行稀釋,其稀釋倍數(shù)不得超過MVD。 一般稀釋至MVD;如樣品有干擾作用,選擇符合干擾試驗要求的第二濃度作為日常檢查濃度。陽性對照溶液的制備 用檢查用水將內(nèi)毒素標準品稀釋制成2濃度的內(nèi)毒素標準溶液。 第二十六張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于2022年6月供試品細菌內(nèi)毒素檢查供試品陽性對照溶液的制備 用待檢測的供試品溶液或其稀釋液將內(nèi)毒素標準品制成2濃度的內(nèi)毒素溶液。陰性對照 即細菌內(nèi)毒素檢查用水。鱟試劑的準備 取規(guī)格為0.1ml/支的鱟試劑8支,每支加入0.1ml檢查用水使溶解備用。加樣 8支管中2支加入0.ml供試品溶液或其稀釋液作為供試品管,2支加入0.1ml陽性對照溶液作為陽性對照管,2支加入0.1ml檢查用水作為陰性對照管,2支加入0.1ml供試品陽性對照溶液作為供試品陽性對照管。 將試管中溶液輕輕混勻后,用封口膜封閉管口,垂直放入371水浴或適宜恒溫器中,保溫602分鐘。 第二十七張,PPT共二十九頁,創(chuàng)作于

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