RFLP基因分型在動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)乙型肝炎病毒基因變異中的應(yīng)用

1、RFLP基因分型在動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)乙型肝炎病毒基因變異中的應(yīng)用【關(guān)鍵詞】基因型HBV基因變異為明確乙型肝炎病毒(HBV)基因變異在肝炎發(fā)病機(jī)理中的作用一般需要克隆后測(cè)序，動(dòng)態(tài)比擬肝炎發(fā)病前后的HBV核酸序列變。但是克隆后測(cè)序受混合毒株干擾，不能準(zhǔn)確反映優(yōu)勢(shì)毒株的變化。因此我們研究了應(yīng)用PR產(chǎn)物限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)方法與克隆后測(cè)序相給合，討論其在重型肝炎發(fā)生前后HBVS基因變異研究中的價(jià)值。1材料與方法1.1研究對(duì)象1例重型乙型肝炎(重肝)患者，男性，33歲。根據(jù)1995年全國(guó)病毒性肝炎會(huì)議肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)確診;搜集發(fā)病前6個(gè)月及發(fā)病住院時(shí)的2份血清進(jìn)展分析。1.2血清HBVDNA擴(kuò)增、克隆與測(cè)

2、序常規(guī)抽提血清DNA，用聚合酶鏈反響(PR)擴(kuò)增HBVS基因序列，PR產(chǎn)物直接克隆入Pge-T報(bào)告Easy質(zhì)粒中(Prepa,USA),每份標(biāo)本隨即挑選3個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)展全自動(dòng)測(cè)序(ABI377DNAAutatiSequener,Perkin-Eler，A),PR及測(cè)序引物見(jiàn)表1。用DNASIS軟件處理分析測(cè)序結(jié)果。表1HBV基因PR擴(kuò)增和測(cè)序所用引物略1.3RPLP分析HBV基因型用引物對(duì)YS1和YS2進(jìn)展PR擴(kuò)增S基因nt48-633之同片段，長(zhǎng)度為586bp。以B、為優(yōu)勢(shì)基因型的地區(qū),PR產(chǎn)物先經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶Sty1和Bsr平行酶切，疑膠電泳后可明確鑒定B型(127bp，459bp)和型3

3、33bp，253bp,并可區(qū)分A型和D型。根據(jù)需要再經(jīng)Hpa2或Dpnl酶切分型。2結(jié)果RFLP分析各克隆序列HBV基因型，重肝前后標(biāo)本均為B、混合型，以B型為主。應(yīng)用s區(qū)序列同源性比擬方法1，分析克隆基因型。重型肝炎前3個(gè)克隆l株(LI)為基因型(血清型adr)，2株(L2.L3)為B基因型；重型肝炎發(fā)生后3個(gè)克隆(H1、H2、H3)均為B基因型血清目adu。HBVS基因克隆后序列比擬分析L1株血清型為adr基因型為型，與中國(guó)基因型流行株標(biāo)準(zhǔn)參照序列比擬，前S/S區(qū)共有11個(gè)位點(diǎn)變異，S區(qū)nt668-669間有31bp的插入變異；分析2份血血清克隆(Ll-L3與Hl-H3)的差異.有170個(gè)

4、位點(diǎn)不同；僅分析優(yōu)勢(shì)B基因型毒株(L2-L3與H1-H3)，存在54個(gè)位點(diǎn)差異；基因型克隆(L1)與B基因型克隆間有87個(gè)位點(diǎn)的差異(圖1)。3討論3.1動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)HBV變異的克隆后測(cè)序方法的弊端HBV現(xiàn)分為7種基因型2。不同基因型間序列差異較大8%異質(zhì)性)。由于慢性HBV感染易出現(xiàn)野毒株和變異株混合感染及不同基因型毒株感染，在分析不同克隆株時(shí)就極可能因以上不同基因型混合毒株感染而使結(jié)果判斷錯(cuò)誤，易將不同基因型間毒株序列差異誤判為基因位點(diǎn)改變或基因變異。因此，在分析克隆測(cè)序結(jié)果前需判斷該標(biāo)本是否存在不同基因型的混合毒株感染，以及確定為何種基因型毒株感染。3.2RFLP對(duì)HBV基因型設(shè)計(jì)本設(shè)計(jì)是基

5、于分析GenBank中189株全序列(24株A型、35株B型、85株型、37株D型、4株E型和3株F型)S基因nt48-633序列對(duì)齊比擬，發(fā)現(xiàn)限制性?xún)?nèi)切酶sty1存在于多數(shù)型序列中；Bsr1第174位酶切位點(diǎn)是B型獨(dú)有的。E、A型Bsr1酶切位點(diǎn)位于第348位(301bp,285bp)。Hpa2僅在E型第nt552位有酶切位點(diǎn)(81bp,504bp)。Dpn1酶可準(zhǔn)確鑒定90%的F型和剩余的少數(shù)A、型：型中無(wú)該酶位點(diǎn)；B、E及D型酶切位點(diǎn)在nt337位；半數(shù)A型有2個(gè)位點(diǎn)(nt131和nt337位)；在F型中有2個(gè)位點(diǎn)(nt337和nt593位)。D基因型全長(zhǎng)在nt2851后缺失33個(gè)堿基。

6、用YPl及Yp3引物擴(kuò)增前S1基因，可鑒定D基因型:非D基因型PR產(chǎn)物長(zhǎng)度為222bp，D基因型長(zhǎng)度為189bp。不同地區(qū)可根據(jù)其流行株基因型不同，選用不同內(nèi)切酶組合。由于我國(guó)流行的HBV主要是B、型3，我們選用了sty1和Bsr1結(jié)合酶切鑒定不同克隆基因型。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3.3RFLP在HBVS基因克隆分析中的應(yīng)用評(píng)估RFLP先行分析2份血清中HBV毒株，確定為以B基因型為優(yōu)勢(shì)的B/型混合感染。分析2份血清別離的克隆間的核酸序列差異，有170個(gè)位點(diǎn)不同；而去除非優(yōu)勢(shì)毒株基因型L1克隆，僅分析優(yōu)勢(shì)B基因型毒血清亞型為ad)，結(jié)果有54個(gè)位點(diǎn)差異。顯然基因型克隆(L1)與B基因型克隆間有

7、87位點(diǎn)的差異屬于B/基因型間的差異。由于慢性HBV感染毒株多以混合形式存在4，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)同一毒株基因變異在技術(shù)上尚難做到，代之以監(jiān)測(cè)優(yōu)勢(shì)毒株基因變異卻是可行的。隨機(jī)挑取少量的克隆株有可能是非優(yōu)勢(shì)毒株，而選取大量克隆株又會(huì)成倍增加工作量和研究費(fèi)用。為解決這一矛盾，我們選取另一思路采用簡(jiǎn)便快捷方法先確定優(yōu)勢(shì)毒株基因型，以此為參照應(yīng)用于克隆株的分析，篩除非優(yōu)勢(shì)毒株對(duì)序列分析的干擾，使結(jié)果分析更實(shí)際、準(zhǔn)確。這一思路方法在本研究應(yīng)用中因確定了L1株為基因型株先行去除，只分析優(yōu)勢(shì)B基因型毒株，大大簡(jiǎn)化了分析的難度與偏向?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1DkatH，TsudaF，TanakaT，etal.Typinghepa

8、titisBvirusbyhlgyinnuletidesequene：parisnfsurfaesubtypeJ.JGenVirl，1988，69：2575.2StuyverL，DeGendtS，VanGeyt，etal.AnegentypefhepatitisBvirus：pletegeueandphylgenetirelatednessJ.JGenVirl，2000，81：67.3范金水，莊輝，李永貴，等.我國(guó)八大城市HBsAg陽(yáng)性和陰性乙型肝炎患者的病毒血清和基因型分析J.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，1998，181：88.4HuJ，LauGKK，heng，etal.T1762A1764VariantfthebasalreprterfhepatitisBvirus：ser