RFLP基因分型在動態(tài)監(jiān)測乙型肝炎病毒基因變異中的應(yīng)用

1、RFLP基因分型在動態(tài)監(jiān)測乙型肝炎病毒基因變異中的應(yīng)用【關(guān)鍵詞】基因型HBV基因變異為明確乙型肝炎病毒(HBV)基因變異在肝炎發(fā)病機理中的作用一般需要克隆后測序，動態(tài)比擬肝炎發(fā)病前后的HBV核酸序列變。但是克隆后測序受混合毒株干擾，不能準確反映優(yōu)勢毒株的變化。因此我們研究了應(yīng)用PR產(chǎn)物限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)方法與克隆后測序相給合，討論其在重型肝炎發(fā)生前后HBVS基因變異研究中的價值。1材料與方法1.1研究對象1例重型乙型肝炎(重肝)患者，男性，33歲。根據(jù)1995年全國病毒性肝炎會議肝炎診斷標準確診;搜集發(fā)病前6個月及發(fā)病住院時的2份血清進展分析。1.2血清HBVDNA擴增、克隆與測

2、序常規(guī)抽提血清DNA，用聚合酶鏈反響(PR)擴增HBVS基因序列，PR產(chǎn)物直接克隆入Pge-T報告Easy質(zhì)粒中(Prepa,USA),每份標本隨即挑選3個陽性克隆進展全自動測序(ABI377DNAAutatiSequener,Perkin-Eler，A),PR及測序引物見表1。用DNASIS軟件處理分析測序結(jié)果。表1HBV基因PR擴增和測序所用引物略1.3RPLP分析HBV基因型用引物對YS1和YS2進展PR擴增S基因nt48-633之同片段，長度為586bp。以B、為優(yōu)勢基因型的地區(qū),PR產(chǎn)物先經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sty1和Bsr平行酶切，疑膠電泳后可明確鑒定B型(127bp，459bp)和型3

3、33bp，253bp,并可區(qū)分A型和D型。根據(jù)需要再經(jīng)Hpa2或Dpnl酶切分型。2結(jié)果RFLP分析各克隆序列HBV基因型，重肝前后標本均為B、混合型，以B型為主。應(yīng)用s區(qū)序列同源性比擬方法1，分析克隆基因型。重型肝炎前3個克隆l株(LI)為基因型(血清型adr)，2株(L2.L3)為B基因型；重型肝炎發(fā)生后3個克隆(H1、H2、H3)均為B基因型血清目adu。HBVS基因克隆后序列比擬分析L1株血清型為adr基因型為型，與中國基因型流行株標準參照序列比擬，前S/S區(qū)共有11個位點變異，S區(qū)nt668-669間有31bp的插入變異；分析2份血血清克隆(Ll-L3與Hl-H3)的差異.有170個

4、位點不同；僅分析優(yōu)勢B基因型毒株(L2-L3與H1-H3)，存在54個位點差異；基因型克隆(L1)與B基因型克隆間有87個位點的差異(圖1)。3討論3.1動態(tài)監(jiān)測HBV變異的克隆后測序方法的弊端HBV現(xiàn)分為7種基因型2。不同基因型間序列差異較大8%異質(zhì)性)。由于慢性HBV感染易出現(xiàn)野毒株和變異株混合感染及不同基因型毒株感染，在分析不同克隆株時就極可能因以上不同基因型混合毒株感染而使結(jié)果判斷錯誤，易將不同基因型間毒株序列差異誤判為基因位點改變或基因變異。因此，在分析克隆測序結(jié)果前需判斷該標本是否存在不同基因型的混合毒株感染，以及確定為何種基因型毒株感染。3.2RFLP對HBV基因型設(shè)計本設(shè)計是基

5、于分析GenBank中189株全序列(24株A型、35株B型、85株型、37株D型、4株E型和3株F型)S基因nt48-633序列對齊比擬，發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶sty1存在于多數(shù)型序列中；Bsr1第174位酶切位點是B型獨有的。E、A型Bsr1酶切位點位于第348位(301bp,285bp)。Hpa2僅在E型第nt552位有酶切位點(81bp,504bp)。Dpn1酶可準確鑒定90%的F型和剩余的少數(shù)A、型：型中無該酶位點；B、E及D型酶切位點在nt337位；半數(shù)A型有2個位點(nt131和nt337位)；在F型中有2個位點(nt337和nt593位)。D基因型全長在nt2851后缺失33個堿基。

6、用YPl及Yp3引物擴增前S1基因，可鑒定D基因型:非D基因型PR產(chǎn)物長度為222bp，D基因型長度為189bp。不同地區(qū)可根據(jù)其流行株基因型不同，選用不同內(nèi)切酶組合。由于我國流行的HBV主要是B、型3，我們選用了sty1和Bsr1結(jié)合酶切鑒定不同克隆基因型。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3.3RFLP在HBVS基因克隆分析中的應(yīng)用評估RFLP先行分析2份血清中HBV毒株，確定為以B基因型為優(yōu)勢的B/型混合感染。分析2份血清別離的克隆間的核酸序列差異，有170個位點不同；而去除非優(yōu)勢毒株基因型L1克隆，僅分析優(yōu)勢B基因型毒血清亞型為ad)，結(jié)果有54個位點差異。顯然基因型克隆(L1)與B基因型克隆間有

7、87位點的差異屬于B/基因型間的差異。由于慢性HBV感染毒株多以混合形式存在4，動態(tài)監(jiān)測同一毒株基因變異在技術(shù)上尚難做到，代之以監(jiān)測優(yōu)勢毒株基因變異卻是可行的。隨機挑取少量的克隆株有可能是非優(yōu)勢毒株，而選取大量克隆株又會成倍增加工作量和研究費用。為解決這一矛盾，我們選取另一思路采用簡便快捷方法先確定優(yōu)勢毒株基因型，以此為參照應(yīng)用于克隆株的分析，篩除非優(yōu)勢毒株對序列分析的干擾，使結(jié)果分析更實際、準確。這一思路方法在本研究應(yīng)用中因確定了L1株為基因型株先行去除，只分析優(yōu)勢B基因型毒株，大大簡化了分析的難度與偏向?！緟⒖嘉墨I】1DkatH，TsudaF，TanakaT，etal.Typinghepa

8、titisBvirusbyhlgyinnuletidesequene：parisnfsurfaesubtypeJ.JGenVirl，1988，69：2575.2StuyverL，DeGendtS，VanGeyt，etal.AnegentypefhepatitisBvirus：pletegeueandphylgenetirelatednessJ.JGenVirl，2000，81：67.3范金水，莊輝，李永貴，等.我國八大城市HBsAg陽性和陰性乙型肝炎患者的病毒血清和基因型分析J.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，1998，181：88.4HuJ，LauGKK，heng，etal.T1762A1764VariantfthebasalreprterfhepatitisBvirus：ser