腸三葉因子對新生鼠壞死性小腸結(jié)腸炎模型IL

1、腸三葉因子對新生鼠壞死性小腸結(jié)腸炎模型IL【關(guān)鍵詞】腸三葉因子；壞死性小腸結(jié)腸；摘要：目的：研究腸三葉因子(intestinaltrefilfatr,ITF)對壞死性小腸結(jié)腸炎(nertizingenterlitis,NE)新生大鼠的腸粘膜組織中IL10的含量的影響，討論ITF對NE保護(hù)作用機(jī)理。方法：建立NE模型，取腸組織待檢。新生鼠32只隨機(jī)分為4組，每組8只。A組為正常對照組；B組為NE模型組；組為NE模型后予以皮下注射生理鹽水02l；D組為NE模型后予以皮下注射ITF02g。取近回盲部12腸道組織固定包埋、切片、HE染色做病理學(xué)檢查，其它腸道組織制備組織勻漿取上清液檢測IL10的含量。

2、結(jié)果：B、組組織勻漿中IL10的含量(pg/gpr)較A組無顯著差異(P0.05)；D組較A、B、組明顯升高(P0.01)。病理切片顯示B、組HE染色切片見腸壁損傷輕重不一，可見全腸粘膜絨毛壞死，病理評分的中位積分為3分；D組腸上皮細(xì)胞少量脫落，頂端絨毛壞死，病理評分的中位積分為1分。結(jié)論：通過皮下注射ITF可以減輕NE后的腸道炎癥反響，ITF有可能為治療NE提供新的方法。關(guān)鍵詞：腸三葉因子；壞死性小腸結(jié)腸；IL10壞死性小腸結(jié)腸炎(nertizingenterlitis,NE)是新生兒時期嚴(yán)重的腸道疾病，也是新生兒尤其是未成熟兒早期死亡的主要原因，但其發(fā)病機(jī)制仍未完全清楚。目前認(rèn)為NE是出于

3、早產(chǎn)、缺氧、腸道喂養(yǎng)、細(xì)菌感染、腸道缺血等多種因素參與引起的腸壞死，牽涉到細(xì)胞因子與炎癥因子等變化。腸三葉因子(intestinaltrefilfatr,ITF)為三葉肽家族之一，研究說明，ITF具有很強(qiáng)的細(xì)胞保護(hù)作用，可明顯減輕多種損傷因子介導(dǎo)腸粘膜損害，它不僅具有一般生長因子所具有的促進(jìn)細(xì)胞增殖與移行的才能，還具有獨(dú)特的生理功能，即同粘液糖蛋白結(jié)合，穩(wěn)定腸粘液層。因此ITF在腸道的自我保護(hù)和損傷后修復(fù)機(jī)制中占據(jù)重要地位1。LinJ2等認(rèn)為，早產(chǎn)兒易患NE是由于相對缺乏ITF所致。本研究采用新生istar大鼠的NE模型，以給ITF為陽性對照，檢測NE后腸粘膜組織勻漿中IL10含量及腸道病理組

4、織學(xué)檢查，旨在討論ITF對NE的保護(hù)作用。1材料和方法11實驗動物及分組新生1日齡istar大鼠鼠嬰，雌雄不限，體重510g,由武漢大學(xué)人民醫(yī)院科教處動物實驗室提供。與母鼠同籠，母乳喂養(yǎng)。母鼠自由飲水，喂以條桿狀動物飼料，室溫1525，自然采光。32只新生鼠隨機(jī)分為4組,每組8只。A組為正常對照組；B組為NE模型組；組為NE模型后予以皮下注射生理鹽水0.2l；D組為NE模型后予以皮下注射ITF0.2g。12主要試劑基因重組人小腸三葉因子(hITF)由北京大學(xué)蛋白質(zhì)工程及植物基因工程國家重點(diǎn)實驗室提供；IL10購于上海增健公司；雙縮脲檢測試劑合購自南京建成生物工程研究所。13新生istar鼠壞死

5、性小腸結(jié)腸炎模型的制作3先給缺氧艙通入氮?dú)?，調(diào)節(jié)流速，應(yīng)用RSS5100型便攜式數(shù)字測氧儀，測得艙內(nèi)氮?dú)鉂舛冗_(dá)100%維持在(99.960.2)%后，放入1日齡新生鼠1分鐘后取出，接著放4冷環(huán)境中持續(xù)10in，每天兩次。待治療組給藥后所有新生鼠均放回母鼠身邊喂養(yǎng)，連續(xù)3天。至第4天斷頭處死新生鼠，取出十二指腸下端至直腸上端的腸道組織待檢。腸道移出后，肉眼觀察NE征象：腸變色、出血、回腸脹氣或狹窄。分別在十二指腸、小腸的近中遠(yuǎn)端及結(jié)腸的近端和遠(yuǎn)端處取12代表段，用10%的甲醛立即固定，常規(guī)石蠟包埋，分別作組織形態(tài)學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)檢測。14腸道組織病理學(xué)檢查取上述近回盲段腸道組織12立即固定于

6、10%甲醛中，石蠟包埋，切片，用蘇木素伊紅(HE)染色作組織病理學(xué)檢查。腸組織病理評分標(biāo)準(zhǔn)采用雙盲法評分4：0分，腸粘膜絨毛正常；1分，輕度腸上皮細(xì)胞脫落；2分，為中度伴有中度絨毛壞死；3分，為重度伴有全絨毛壞死；4分，透壁壞死。15腸組織勻漿上清液中IL10含量的測定將腸道組織其余部分在冰冷的生理鹽水中漂洗、濾紙拭干稱重約10g左右，在冰水環(huán)境下用生理鹽水和勻漿器制作成2l腸組織勻漿，在4低溫離心機(jī)3500r/in離心15分鐘后取上清液分裝于EP管中，置于-20冰箱中冷藏。采用Elisa雙抗夾心法檢測腸道組織勻漿中的IL10的含量，蛋白定量(雙縮脲法)均按說明書進(jìn)展操作檢測。16統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)

7、果以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示。比擬采用方差分析，用SPSS110統(tǒng)計軟件進(jìn)展統(tǒng)計分析。病理積分采用Ridit分析，P0.05為顯著性檢驗標(biāo)準(zhǔn)。2結(jié)果21腸道組織病理學(xué)改變的比擬B、組病理組織學(xué)改變積分范圍14分，有絨毛縮短的淺表上皮損傷到全粘膜壞死；D組病理組織學(xué)改變積分范圍從02分，表現(xiàn)為小血管充血和少量的絨毛上皮細(xì)胞壞死。而B、D組與A組比擬，P0.01。22組織勻漿上清液中IL10含量A、B、組IL10含量低于D組，差異有顯著性(P0.01)，見表1。表1腸組織勻漿上清液中IL10含量注：與A、B組比擬，#P0.05；與D組比擬，*P0.01。3討論壞死性小腸結(jié)腸炎是新生兒時期嚴(yán)重的腸道疾病

8、，也是新生兒尤其是未成熟兒早期死亡的重要原因，且隨著低出生體重兒存活率的增加，NE的發(fā)病率呈上升趨勢。其發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚，目前認(rèn)為NE是由于早產(chǎn)、缺氧、腸道喂養(yǎng)、細(xì)胞感染、腸道缺血等多種因素參與引起的腸壞死，牽涉到細(xì)胞因子與炎癥因子等變化。但研究說明缺氧在NE的病因中起著重要的作用，缺氧能使粘膜血流降低及誘導(dǎo)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的早期改變，最終導(dǎo)致腸道壞死。以前研究說明早產(chǎn)新生兒的腸道屏障對內(nèi)臟的低灌注特別敏感，假設(shè)圍產(chǎn)期損傷導(dǎo)致腸系膜循環(huán)障礙，那么可能誘導(dǎo)腸粘膜損傷，而導(dǎo)致部分的微生物群入侵粘膜屏障，這一過程導(dǎo)致炎癥的級聯(lián)放大反響，最終導(dǎo)致全腸道的NE。致炎癥細(xì)胞因子在上面提到的炎癥級聯(lián)放大

9、反響是起著重要的作用，并且均參與了NE的發(fā)病過程中，同時也啟動了機(jī)體的抗炎反響及自動修復(fù)機(jī)制。ITF由腸道杯狀細(xì)胞合成，它能抵抗蛋白酶的消化，并為上皮細(xì)胞提供理想的保護(hù)。在離體和體內(nèi)的研究中說明ITF在保護(hù)腸道粘膜的完好性、促進(jìn)腸粘膜損傷后的重建與修復(fù)以及在腸粘液細(xì)胞的抗凋亡中有重要的作用。研究顯示缺乏ITF的小鼠在粘膜損傷后不能很好愈合；而在小鼠的回腸末端過表達(dá)ITF的轉(zhuǎn)基因鼠能明顯抵抗腸道損傷；在急性結(jié)腸炎中ITF的修復(fù)才能被明顯加強(qiáng)；重組ITF能部分保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受缺氧誘導(dǎo)的屏障功能障礙59。本實驗研究亦顯示，在低氧誘導(dǎo)的新生istar鼠的NE的模型中，ITF明顯緩解了新生鼠NE模型的組

10、織學(xué)損傷，由此提示ITF可用于緩解NE，但其作用機(jī)理仍不完全清楚。最近研究說明10，抗炎癥因子IL10在NE的發(fā)病機(jī)理中起著重要的作用。IL10是由單核巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞Th細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生，具有抗炎癥特性，可以抑制多種致炎癥因子和細(xì)胞介質(zhì)免疫合成。研究說明，剔除了IL10的鼠能自發(fā)開展為慢性腸道炎癥，而且在鼠的炎癥性腸道疾病模型中，持續(xù)予以IL10干預(yù)可以阻止炎癥性腸道疾病的開展，因此，在我們的NE模型鼠中，內(nèi)源性IL10含量的改變在NE的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵的作用。早產(chǎn)鼠細(xì)菌聚集在NE發(fā)病中起著重要的作用，而且已報道，抗生素能降低人和動物NE的發(fā)病率，盡管這一作用的分子機(jī)制仍不清楚，但研究已

11、說明，抗生素治療可以誘導(dǎo)腸道粘膜內(nèi)源性IL10的表達(dá)。總之，新生鼠NE是研究人NE發(fā)病機(jī)理高度相關(guān)和有價值的模型。我們研究說明，ITF對NE的保護(hù)作用是與新生鼠模型中腸道IL10含量升高相關(guān)的，這一發(fā)現(xiàn)可能為新生兒NE的防治工作開拓了一個新的視野。參考文獻(xiàn)1arhbankT,xH,GdladRA,etal.Effetfetpiexpressinfrattrefilfatrfaily3(intestinaltrefilfatr)inthejejunuftransgeniie.JBilhe.2001,276(26):2408824096.2LinJ,HlzanIR,JiangP,etal.Expr

12、essinfintestinaltrefilfatrindevelpingratintestineBilNenate.1999,76(2):9297.3DvrakB,HalpernD,HlubeH,etal.Epideralgrthfatrreduesthedevelpentfnertizingenterlitisinanenatalratdel.AJPhysilGastrintestLiverPhysil.2002,282(1):G156164.4aplanS,illerathpleR,KaupS,etal.BifidbaterialsuppleentatinreduestheinidenefnertizingenterlitisinanenatalratdelGastrenterlgy.1999,117(3):577583.5嚴(yán)彩