微波法與高溫高壓法抗原修復的探討

1、微波法與高溫高壓法抗原修復的討論【摘要】目的：討論微波法與高溫高壓法對抗原修復的效果。方法：分別應用微波輻射法、高壓鍋直接煮沸法進展抗原修復，行免疫組化染色并比擬其應用效果。結果：微波修復背景較明晰，陽性細胞表達在應該出現(xiàn)的標本切片中可以見到但表達不明顯。使用高壓鍋修復，這樣修復的效果是背景干凈明晰而且陽性信號強。結論：高溫高壓法較微波法切片背景干凈,顯色比照鮮明，構造明晰，定位準確，易于觀察，方法穩(wěn)定，結果可靠，可進步病理診斷的準確性?！娟P鍵詞】抗原修復免疫組織化學免疫組織化學染色技術以其操作簡單，敏感性高，特異性強，能將形態(tài)和抗原定位結合起來等優(yōu)點廣泛應用于腫瘤臨床病理診斷和鑒別診斷。因此

2、免疫組織化學染色結果的可靠性受到了極大的關注，目前操作中最突出的問題是抗原修復的問題，我們對常用的抗體比擬了微波爐加熱和壓力鍋高溫高壓兩種修復方法，先將結果總結如下。1材料與方法1.1儀器市售家用壓力鍋，工作壓力為90kPa，惠而浦微波爐。1.2試劑ER、PR、-erbB-2試劑為北京中杉金橋生物技術消費的試劑，加熱修復液為枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)。1.3材料搜集本院乳腺癌患者標本20例，10%福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切片34。每例均切6張，附貼于涂有多聚L賴氨酸的玻片上，置60烤箱內(nèi)烘烤。分別用于微波輻射法與高壓鍋直接煮沸法進展抗原修復，然后進展免疫組化染色。1.4方法微波輻射法：石

3、蠟切片脫蠟至水。PBS浸泡2in3次，先將修復液燒開，溫度為95100然后將切片放入修復液中，加熱3in，此時降低火力持續(xù)15in20in。然后自然冷卻。3%H22室溫孵育5in10in，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性蒸餾水沖洗PBS浸泡2in3次滴加一抗工作液，37孵育1h2h或4過夜PBS沖洗2in3次滴加適當量的二抗，37孵育0.5hPBS沖洗2in3次顯色劑顯色DAB自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。高壓鍋直接煮沸法：石蠟切片脫蠟至水。PBS浸泡2in3次將修復液燒開后將切片放入高壓鍋中，然后蓋好蓋子，加上氣壓閥，繼續(xù)加熱至噴汽時,即到達工作溫度和工作壓力,開場計時2in后壓力鍋分

4、開熱源，自然冷卻。余同微波輻射法。免疫組化陽性標準斷定：陽性細胞為棕黃色，ER、PR陽性顆粒定位于細胞核，-erbB-2陽性顆粒定位于細胞膜。陽性對照選擇預試驗陽性切片，陰性對照用PBS代替一抗。2結果20例乳腺癌切片經(jīng)微波修復者，ER、PR10例呈陽性表達，陽性率為50%，呈強陽性表達者僅3例15%。-erbB-28例呈陽性表達，陽性率為40%，均呈弱陽性表達。背景較明晰，陽性細胞表達在應該出現(xiàn)的標本切片中可以見到但表達不明顯，即陽性強度弱，陽性細胞數(shù)少。而使用高壓鍋煮沸法ER、PR16例呈陽性表達，表達陽性率80%，呈強陽性表達1260%。-erbB-210例呈陽性表達，陽性率為50%，均

5、呈強陽性表達。高壓鍋煮沸法背景更干凈、明晰，陽性信號強、表達細胞數(shù)量也較多。3討論免疫組織化學技術是免疫學與分子生物學技術和病理形態(tài)結合的一門新興學科。它是一種用抗體或抗原檢測組織細胞中的抗原或抗體的技術，具有操作簡單、敏感性高、特異性強及將形態(tài)、代謝和機能親密集合起來等優(yōu)點，已廣泛用于病理診斷、鑒別診斷。乳腺癌ER、PR、-erbB-2的檢測可用于指導臨床用藥及判斷預后。但經(jīng)10%福爾馬林固定石蠟包埋的切片，組織中的許多抗原決定簇被醛基交聯(lián)封閉，以致于無法和抗體結合，從而影響染色結果2。因此組織中抗原性修復技術與免疫組織化學染色的成敗有非常親密的關系。我們應用微波輻射法和高壓鍋直接煮沸法對2

6、0例乳腺癌組織切片分別進展抗原修復，以觀察其對乳腺癌ER、PR、-erbB-2染色效果的影響。我們的體會如下?？乖瓱嵝迯偷脑蚝屠碚摳资峭ㄟ^加熱水解被醛基交聯(lián)封閉的許多抗原決定簇，使抗原決定簇被激活?？乖迯偷挠行允侵讣訜釡囟萒加熱時間t。所以修復的溫度和修復的時間非常重要。用微波爐做抗原修復，使用方便但溫度不易掌握，很容易受外界因素的影響：比方修復液的起始溫度不同時要適當改變預熱的時間；微波爐使用一定時間后，即使一樣的加熱時間也可能會出現(xiàn)溫度不同；修復液的量不同加熱所需要的時間也不同；預熱后維持的時間不夠也會使抗原暴露不充分等等。用微波爐做抗原修復還要注意預熱的溫度，一定要到達95100，并且要在預熱溫度的根底上維持15in20in，這樣才能到達使抗原決定簇完全暴露的目的。另外緩沖液沸騰可導致脫片，且金屬儀器均不能使用，有一定的局限性。假如選用高壓鍋修復就可以防止因為外界環(huán)境改變所導致的對溫度的影響，因此高壓抗原修復法在染色強度和重復性等方面優(yōu)于微波法3。文獻報道，紀小龍等4曾對43種抗體進展了微波輻射和高壓加熱比照觀察，結果發(fā)現(xiàn)，17種抗體經(jīng)高壓方法處理后，染色效果明顯增強，與我們的實驗結果一樣。因高壓抗原修復法不必改變修復預熱條件，只要高壓鍋噴氣2in2.5in的狀態(tài)下那么溫度就在120，所以不必去測量溫度，也不用改變操作條件，既有操作方便、省時間、受熱均勻的優(yōu)點，又可