利用微生物全細(xì)胞方法通過-羥基化2-苯乙酸衍生物和還

1、利用微生物全細(xì)胞方法通過- 羥基化 2- 苯乙酸衍生物和復(fù)原 - 酮酯制備互為對應(yīng)異構(gòu)體的S和 R- 扁桃酸衍生物摘要：利用不同分類群的41 種微生物通過對映挑選法復(fù)原苯甲酰甲酸甲酯得到 R - 扁桃酸甲酯,對映體變量中等偏高；相反,長蠕孢菌中的單加氧酶 CIOC3.3316催化羥基化的 2- 苯乙酸甲酯得到 S- 扁桃酸甲酯；這種氧化和復(fù)原生物轉(zhuǎn)化的結(jié)合供應(yīng)了一種制備手性- 羥酸衍生物對映體的方法；一、簡介 由于對不對稱合成愛好的逐步增加, 促進(jìn)了在有機(jī)合成中生物轉(zhuǎn)化方面取得 了很大的進(jìn)展,并且已經(jīng)廣泛的用于手性化合物的合成中；光學(xué)純的- 羥酸與 其衍生物是合成大量不同生物活性分子和其他精細(xì)

2、化學(xué)藥品的重要的根底；此 外,扁桃酸和其衍生物已經(jīng)發(fā)覺是手性拆分過程中藥物制劑和拆分劑的萬能媒介物；由于對這些化合物產(chǎn)生了深厚的愛好,以開發(fā)了幾種方法用來得到其光學(xué)純形式；包括,動態(tài)拆格外消旋的- 羥酸酯,水解 cyabohydrin 以與復(fù)原前手性的 - 酮酯；然而,扁桃酸甲酯和其衍生物很難從他們對應(yīng)的前手性芳香族的羧基誘導(dǎo)劑通過C-H 氧化得到；區(qū)域和立體挑選的羥基化2- 苯乙酸衍生物是制備有旋光性的扁桃酸衍生物最簡潔的途徑；然而,在合成化學(xué)中區(qū)域和立體挑選羥基化有活性的 C-H 仍舊是一個挑戰(zhàn)； 除此之外,羥化反響可能是這類轉(zhuǎn)化的一種 有效途徑；Adma等人報道, - 氧化的長鏈羧酸通過

3、豌豆中的氧化酶作用得到有旋光活 性 2- 羥酸；目前, Arnold 等人首次利用設(shè)計的細(xì)胞色素 P450BM-3對映挑選氧 DOC. 化 1 形成 S-2 ；然而,設(shè)計過的細(xì)胞色素P450BM-3與 2- 苯乙酸的的反響收率中等偏低并且對映體過量中等偏高82-90%；Holland 小組報道與長蠕孢菌NRRL4671作用的長鏈鏈腈 C6-C10后可得到低產(chǎn)量的 R-2- 鏈烯醇8-19%并且有很高的光學(xué)純度ee95%；在這當(dāng)中,我們報道了一種微生物菌株長蠕孢菌CIOC3.3316使 2- 苯乙酸甲酯通過羥基化作用生成 S- 扁桃酸甲酯,并且有很高的對映挑選性92%ee；此外,這篇文獻(xiàn)中同樣報

4、道了對一些可以復(fù)原苯甲酰甲酸甲酯生成R- 扁桃酸甲酯微生物進(jìn)展的爭論； 這種氧化和復(fù)原生物轉(zhuǎn)化的結(jié)合供應(yīng)了一種制備手性- 羥酸衍生物對映體的方法；圖 1二、結(jié)果與爭論2.1 氧化從表 1 顯示的結(jié)果來看,長蠕孢菌CIOC3.3316對 S- 構(gòu)型有很強(qiáng)的立體挑選性；菌株 1,3-5 出現(xiàn)出很低的活性或者沒有活性；然而,長蠕孢菌CIOC3.3316的對扁桃酸甲酯的產(chǎn)率卻達(dá)到 目前,Arnold 等人首次利用設(shè)計的細(xì)胞色素62%并且對映體過量為 92%菌株 2；P450BM-3BM-3從大地懶屬桿菌中別離得到對映挑選氧化 1 形成 S-290%對映體過量,其能夠?qū)τ程暨x在某一羧基和肽基團(tuán)的- 位發(fā)

5、生羥基化作用； 相比 Arnold 等人的爭論, 我們采納野生菌株長蠕孢菌 CIOC3.3316作為生物催化劑,同時 S-2 由休眠的全細(xì)胞制備,對映體過量為 92%；另外,全細(xì)胞發(fā)酵供應(yīng)了個不同的方法克制幫助因子阻礙：這種阻礙是由于活體總是供應(yīng)自然循環(huán)時所需要的全部要素；因此可以防止蛋白質(zhì)提純這個繁瑣的過程,并且也不被酶可能有的不穩(wěn)固性的所限制；多DOC. 數(shù)情形下, 細(xì)胞的培育和貯存是很簡潔的, 因此代表這個催化實體是可復(fù)原的資 源；我們爭論組發(fā)覺微生物菌株的全細(xì)胞長蠕孢菌CIOC3.3316表現(xiàn)出像生物催化劑一樣的高的羥化酶的活性,將組成一個新的微生物羥基化系統(tǒng)；反映條件,電子和立體作用

6、與芳香族和脂肪族羧酸酯區(qū)域與對映挑選的羥基化作用之間的相互關(guān)系也在爭論中；2.2 復(fù)原表 2 中概述了對發(fā)生復(fù)原反響的微生物進(jìn)展挑選的結(jié)果；對 41 種微生物菌株復(fù)原產(chǎn)率的評估,其中 10 種菌催化復(fù)原酮酯 3 生成相應(yīng)的羥基酸酯 4,產(chǎn)率很高 90%,菌株 3-12 ；這其中的6 種菌念珠地絲菌 CIOC2.616, 念珠地絲菌 CIOC2.1062, 念珠地絲菌 CIOC SY1, 釀酒酵母 CIOC2.1396, Yarrowia lipolytica CIOC 2.1506 復(fù)原酮酯 1 生成相應(yīng) R- 扁桃酸酯,對映挑選性高對映體過量 90%-95%,菌株 3-5 ,7,9,11；對

7、于立體挑選,八種菌毛孢 子菌 CIOC2.25, 念珠地絲菌 CIOC2.1080, 念珠地絲菌 CIOC2.616, 念珠地絲 菌 CIOC2.1062, 念珠地絲菌 CIOC SY 1, 釀酒酵母 CIOC2.1396, Yarrowia lipolytica CIOC 2.1506遵循“Prelog 原那么生成 R- 扁桃酸鹽,并且沒有任何一種菌株表現(xiàn)出反Prelog 特異性生成 S- 扁桃酸鹽；這些結(jié)果符合“ Prelog 原那么；這個簡潔的模型說明大局部的脫氫酶將氫陰離子傳遞到前手性酮酯的背面；念珠地絲菌 CIOC2.616 被選做是進(jìn)一步預(yù)備合成R- 扁桃酸甲酯最好的菌種；DOC.

8、 三、結(jié)論扁桃酸甲酯的對映體通過復(fù)原苯甲酰甲酸甲酯和氧化 2- 苯乙酸甲酯得 到；一些菌株催化苯甲酰甲酸甲酯的對映挑選的復(fù)原反響有很高的轉(zhuǎn)化率,并且 得到光學(xué)純的 R- 扁桃酸甲酯；另外,以證明長蠕孢菌 CIOC3.3316可以使 2-苯乙酸甲酯發(fā)生羥基化反響生成S- 扁桃酸甲酯；羧酸酯- 位的對映挑選的羥基化反響供應(yīng)了一種新的微生物全細(xì)胞反響類型,并且拓展了一條生成 S-扁桃酸衍生物的新路線； 更重要的是, 這是在沒有溶劑條件下利用微生物細(xì)胞直 接合成 R或者 S- 扁桃酸甲酯的重大進(jìn)展；總之,這將會促進(jìn)綠色可連續(xù) 合成法的開展；四、試驗4.1 概述除非特別說明, 所用的試劑均是購置后直接使

9、用,沒有經(jīng)過進(jìn)一步純化； 化合物 1,化合物 3,對比品和 R- 扁桃酸甲酯是從 Aldrich 化學(xué)公司購置； TLC采納的是硅膠玻璃板；柱層析采納硅膠G200-300 目為固定相,乙酸乙酯 /石油醚為流淌相；1H和13C NMR譜由 Brucker-300 300/75MHz波譜測定儀記錄,CDCl3為溶劑, TMS為內(nèi)標(biāo)物；4.2 微生物的培育挑選的微生物儲存在本試驗室中；酵母菌在含有0.2%w/v 葡萄糖,2%w/v 胨, 1%w/v 酵母菌提取液pH6.8-7.0 的介質(zhì)中生長；細(xì)菌在含有0.1%w/v 氯化鈉,0.5%w/v 牛肉膏, 2%w/v 胨pH6.8 的溶液介質(zhì)中生長；

10、真菌在含有 2%w/v葡萄糖的馬鈴薯上生長；菌株儲存在 4 oC的瓊脂斜面上；取DOC. 錐形瓶,每個裝有適量的100ml 已滅菌的培育液,接種供試菌,在定軌搖床160rpm28 oC進(jìn)展培育；酵母菌、細(xì)菌培育 48 小時,真菌培育 72 小時后,離 心別離細(xì)胞,并用冷的生理鹽水洗兩次；4.3 微生物挑選的特定程序?qū)⑽⑸锛?xì)胞混懸液酵母菌、細(xì)菌、真菌置于10ml50Mm的磷酸氫二鉀緩沖液 Ph7.0中,分別參與苯甲酰甲酸 10.1mmol, 或者 2- 苯乙酸甲酯 30.1mmol；將反響混合物置于定軌搖床160rpm 上 30 oC培育 24h. 在通過 8000g離心機(jī)離心 8 分鐘,取上

11、層溶液用NaCl 飽和,再用乙酸乙酯萃取三次；通過GC或者 HPLC分析法測定產(chǎn)物的產(chǎn)率以與對映體過量；4.4 產(chǎn)物的別離與鑒定2- 苯乙酸甲酯和苯甲酰甲酸甲酯經(jīng)過24小時的生物轉(zhuǎn)化,分別各生成300mg2.0mmol和328mg2.0mmol產(chǎn)物；產(chǎn)物經(jīng)乙酸乙酯萃取,枯燥,濃縮；原 始的反響混合物用快速色譜法 25%乙酸乙酯 / 石油醚 純化；這樣得到的產(chǎn)量分 別是 209mg1.42mmol和268mg1.61mmol,產(chǎn)率 62-81%；濃縮的樣品上 HPLC進(jìn)展 20分析,測定光學(xué)純度； S- 扁桃酸甲酯 D=+130.2c0.8, 甲醇 ,R- 扁 桃酸甲酯 D=+135.6c1.0, 甲醇 ；扁桃酸甲酯的氫譜碳譜如下所示：1H 20NMRCDCl 3,300HZ中： 3.45 s, 1H, 3.76 s, 3H, 5.18 s,1H, 7.377.40 m, 5H； 13C NMR CDCl3, 75Hz中: 174.0, 138.2, 128.5, 128.4, 126.6, 72.8, 53.0；4.5 測定產(chǎn)物構(gòu)型的對映體過量 產(chǎn)物的肯定構(gòu)型通過手性 HPLC利用的R-2 或者 S-2 作為標(biāo)準(zhǔn)品已經(jīng)測出；通過 2- 苯乙酸甲酯和苯甲酰甲酸甲酯生物轉(zhuǎn)化生成的