生物實(shí)驗(yàn)室日常小技巧集錦

1、平時(shí)在最常聽(tīng)到的一句話就是“今天某某試驗(yàn)沒(méi)做好是為什么？今天某某試驗(yàn)沒(méi)出結(jié)果是什么原因？今天某某試驗(yàn)為什么會(huì)是這樣的呢？” 等等。然后仔細(xì)一查找原因，往往是由于操作上面的不認(rèn)真，或是一些小小的細(xì)節(jié)沒(méi)有注意到。以下是集各路朋友的一些經(jīng)驗(yàn)，與大家：1 跑page 膠的時(shí)候，小電壓跑會(huì)避免高電壓產(chǎn)生的熱量爾導(dǎo)致的膠層變形。低電壓泳道會(huì)比大電壓泳道跑的直一些，且分離效果更高，有利于分子量相差不大的蛋白分離。2. 提取質(zhì)粒的時(shí)候，最后一步的揮發(fā)很關(guān)鍵，基本上是其后續(xù)的酶切反應(yīng)的決定性。所以這一步盡量揮發(fā)長(zhǎng)一點(diǎn)時(shí)間，最好是空調(diào)吹熱風(fēng)，或是 37度溫箱放長(zhǎng)一點(diǎn)的時(shí)間，我試過(guò)室溫過(guò)夜，酶切很好。3. 做WES

2、TERN BLOT 的時(shí)候，大家往往會(huì)摸索一抗、二抗的濃度，封閉時(shí)間，時(shí)間等等，而每次變換其中的一個(gè)條件就需要從新跑膠、轉(zhuǎn)膜，甚至重新提蛋白，這樣會(huì)浪費(fèi)大量的時(shí)間。其實(shí)完全沒(méi)有必要這樣。一次轉(zhuǎn)膜后，將 PVDF膜晾干，裁減成小塊，保存起來(lái)，用的時(shí)候取出一塊，沒(méi)有任何影響。這對(duì)于摸索條件的戰(zhàn)友來(lái)說(shuō)，節(jié)約了大量的時(shí)間。4. 有關(guān)緩沖液和培養(yǎng)基配置1）將緩沖液配方中的成分分別以 10100 倍配成母液相應(yīng)的母液混合，補(bǔ)加水稀釋即可，需要的時(shí)候只需將2）配培養(yǎng)基時(shí)通常會(huì)忘記各成分的量，如配LB 時(shí)的三個(gè)成分不記得到底哪個(gè)是 5g，哪個(gè)要 10 個(gè)，因此可以在常用的試劑瓶的上注明所需的量，如配 LB時(shí)，

3、在 NaCl 瓶外注明 10g/L, yeast 5 g/L, tryton 10 g/L 等，很方便，不需要每次配之前臨時(shí)翻書(shū)5. 有關(guān)PCR 主反應(yīng)液配置:在做克隆鑒定的時(shí)候經(jīng)常需要在酶切鑒定前進(jìn)行 PCR 鑒定，每次配置 PCR 反應(yīng)液很繁瑣，可以將其配置類似kit 的形式，按你需要的反應(yīng)體系列表，然后放大100 倍配置 100主反應(yīng)液（100 次反應(yīng)），其中含buffer，Mg2，dNTPs，但不含引物和Taq 酶，然后可以 10分裝或一管在20 度，在需要的時(shí)候拿出融開(kāi)，然后按所需的 PCR 反應(yīng)個(gè)數(shù)吸取相應(yīng)的倍數(shù)，再補(bǔ)加相應(yīng)反應(yīng)倍數(shù)的 Taq和引物，混勻后分裝，這樣做的好處如下：1

4、）可極大的節(jié)省寶貴的時(shí)間，可早點(diǎn)收工，看球避免每次反應(yīng)加樣不均的可能大大減少PCR 假陽(yáng)性的產(chǎn)生6. 有關(guān)酶切反應(yīng)液的配置:在做酶切時(shí)，也可以象 PCR 一樣配置主反應(yīng)液，每次反應(yīng)前先列好反應(yīng)的體系，算好需要的反應(yīng)數(shù)，然后按所需反應(yīng)的體系按所需反應(yīng)數(shù)放大，加入 buffer、酶、水，質(zhì)粒欄空缺，然后混合后按除質(zhì)粒 DNA 的體積分裝，然后再在每管中加入相應(yīng)體積的質(zhì)粒 DNA 酶切，這樣做的好處如下，特別是當(dāng)同時(shí)有 10 幾個(gè)陽(yáng)性克隆需要鑒定時(shí)尤為明顯：各反應(yīng)成分均一可大大減少限制型內(nèi)切酶的使用節(jié)省時(shí)間7. 有關(guān)SDSPAGE：1）可將SDSPAGE 的積層膠，分離膠預(yù)先配好大體積如 100ml

5、在 4箱（注：10AP，TEMED 不加，切記?。?，每次配置時(shí)只需吸取相應(yīng)體積的預(yù)制膠加入 AP，TEMED 即可，沒(méi)必要每次制膠時(shí)候翻分子克隆，特別方便，而且，這樣的預(yù)制膠可半年以上，不失為偷懶的絕佳方法；更關(guān)鍵的是可大大減少與酰胺的接觸，因此大大減少的機(jī)會(huì)。2）電泳時(shí)雖然小電泳分離效果要好一些，但 2 小時(shí)以上的等待的時(shí)間實(shí)在是痛苦，因此可以提高電泳至 150V，但需要將整個(gè)電泳槽放在放滿冰水的臉盆里散熱，這樣跑出來(lái)的膠分離效果絲毫不比低電壓來(lái)的差，關(guān)鍵是時(shí)間，不需 1h 即可看結(jié)果了8. 實(shí)驗(yàn)中小竅門(mén)一些省時(shí)省事能夠分成兩類：一類是“非常規(guī)”操作；一類是常規(guī)操作過(guò)。前一類，我舉個(gè)例子：有

6、時(shí)候第一天涂的轉(zhuǎn)化平板、次日早晨轉(zhuǎn)化子可能長(zhǎng)成的菌落比較大（12 毫米以上，BL21 就長(zhǎng)得快），下一步轉(zhuǎn)化子做質(zhì)粒鑒定。這個(gè)情況下可以直接挑取一塊菌苔（勿帶出培養(yǎng)基），50 微升酚/氯仿懸浮菌體，放置兩分鐘，加 40 微升TE 抽提，上層TE 吸出后再氯仿抽提一次，吸取上層 TE 即是質(zhì)粒提取液。提取的質(zhì)粒可以直接用于電泳和酶切。這樣操作，可以省去轉(zhuǎn)接液體試管的培養(yǎng)步驟，至少節(jié)省 68 小時(shí)的時(shí)間。但是，要在各步驟都控制得很好的情況下才能保證提取和酶切的效果，不同的或者操作者未必能夠很方便地重復(fù)其實(shí)，其它的一些“小竅門(mén)”也是如此。后一類的小竅門(mén)則在中無(wú)處不在。如：平行作不同樣本的 PCR,模

7、板 DNA加量一樣，配置PCR 體系可以一起配制后分裝這點(diǎn)做過(guò)試驗(yàn)的都知道，但是配制的時(shí)候配制量可以比預(yù)期分裝量稍多一點(diǎn)（如用 100 微升則配 110 微升），這樣可以避免有時(shí)候分裝不夠的尷尬，因?yàn)椴煌貏e是大小不同的槍，會(huì)有誤差。再比如：樓上有站友說(shuō)的 sds膠預(yù)配（APS 和TEMED、或者后者先不加），實(shí)際上時(shí)間放置過(guò)長(zhǎng)肯定影響效果，如果要在一天內(nèi)連續(xù)地跑兩次板，可？又比如，配 sds膠的時(shí)候，上層膠和下層膠可以只用一個(gè)大槍頭：先取膠，次取水，取 6.8 的tris 后再取 8.8 的tris，省時(shí)省料。20021108 站友開(kāi)的這個(gè)帖子很好，在上上層樓的帖子說(shuō)得也有道理。但，“竅門(mén)”

8、和“偷懶”不應(yīng)該是因果關(guān)系。其實(shí)，不管是那一類的小竅門(mén)，都是在充分地理解實(shí)驗(yàn)各步驟的原理、經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)積累、再加上一點(diǎn)點(diǎn)思索然后嘗試的結(jié)果。知其然知其所以然和勤于思考敢于探索，是根本。否則，別人的小竅門(mén)對(duì)你也未必能夠有用。才進(jìn)的新手，務(wù)必要先練好規(guī)范扎實(shí)的操作，然后才能弄“竅門(mén)”。本末倒置，貽害無(wú)窮。9. 我一直是把SDSPAGE 的積層膠，分離膠預(yù)先配成mixture，APS 制膠時(shí)加入，半年內(nèi)使用，絕對(duì)沒(méi)有問(wèn)題，我保證。10. 做SDS的時(shí)候，除了蛋白量上樣一致，最好體積也一致，這樣跑出來(lái)的膠各個(gè)泳道之間的band 能做到一樣寬，方便后面的比較，特別是 WB。做法就是拿 1X 的上樣緩沖補(bǔ)

9、全要加的樣做到體積一致，否則跑出來(lái)會(huì)有的寬有的窄，特別是上樣體積相差較大的。11. 在把蛋白膠做成干膠時(shí)，很多時(shí)候會(huì)因?yàn)橛袣馀菔鼓z裂掉，經(jīng)驗(yàn)是在做膠時(shí)加上層膜前在膠上多加些水就不容易進(jìn)氣泡了，還有就是高溫烘膠，我喜歡放到 60 度烘箱里烘，這樣水分蒸發(fā)速度快，即使有一些小的氣泡也不會(huì)有影響，呵呵，這是經(jīng)驗(yàn)之談，我從來(lái)都沒(méi)失手過(guò)，大家可以試試12. 做大腸表達(dá)時(shí)確定蛋白是否表達(dá)一般要煮樣做誘前誘后檢測(cè),但很多時(shí)候煮出來(lái)的很黏影響跑膠效果.我發(fā)現(xiàn)如果現(xiàn)用 8M Urea 重懸細(xì)菌再煮效果會(huì)有極大改善.注:不能用 Gu-HCl 代替13. 我也幾個(gè)偷懶的方法1 做SDS跑膠通常都是現(xiàn)配現(xiàn)用,但配膠要

10、1h,所以如果想第二天睡個(gè)懶覺(jué)而又不耽誤跑膠可以于前一天晚上做好濃縮膠和分離膠,待凝聚后不要拔下梳子,把含膠玻璃板從制膠槽取下,用保鮮膜包上,注意玻璃板上下兩邊緣會(huì)有氣體,所以需要加一點(diǎn)電泳緩沖液以避免膠內(nèi)水分蒸發(fā).然后放 4 度過(guò)夜.第二天直接拔下梳子行后續(xù).國(guó)外好多公司出售腳既是如此,可以保存上.2 配置分離膠或者非變性膠時(shí)因膠凝時(shí)收縮可導(dǎo)致加樣孔變淺.可以將加剩的膠放入 4 度以降低凝聚速度,而將凝膠放入 37 度促聚,并隨時(shí)用 4 度加剩的膠補(bǔ)充下降的膠面.另外將膠橫放與水平面成10 度角也可以減少收縮的影響.3一個(gè)節(jié)約抗體/時(shí)間的做法:同時(shí)跑 2 塊膠,同時(shí)轉(zhuǎn)膜,然后兩塊膜背靠背放入

11、同一膜同時(shí)封閉,同時(shí)一抗二抗(最好是用轉(zhuǎn)輪,這樣效果好.如果是搖床,隔一段時(shí)間幫它們翻個(gè)身以保證兩張膜的正面都有機(jī)會(huì)與液體充分接觸.一起洗膜(可以稍微加強(qiáng)洗膜也可以不做.我最多一張盤(pán)子里放4而沒(méi)有影響洗膜).可分別或同時(shí)壓片.這樣就可以節(jié)約一半抗體和接近一半時(shí)間而不會(huì)影響結(jié)果.或者另外一個(gè)就是孵育后的抗體不要扔,好的抗體可以反復(fù)做好幾呢.但每次都會(huì)減弱,效果不如上面法.14.做 western blotting 轉(zhuǎn)膜時(shí)，膠放在轉(zhuǎn)膜緩沖液中一段時(shí)間，待膠在含有甲醇的緩沖夜中縮小的差不多后裝好轉(zhuǎn)膜裝置經(jīng)驗(yàn)是把膜印在膠上直接在膜上畫(huà)出預(yù)染maker 條帶，方便的很。因?yàn)楹芏鄷r(shí)候跑電泳時(shí)膠上的預(yù)染 m

12、aker 很清楚，等轉(zhuǎn)膜后就不是分辨的很清楚了。不過(guò)要注意畫(huà)好預(yù)染 maker 后就不要使膠和膜發(fā)生對(duì)位移動(dòng)了，以防m(xù)aker 失去參照價(jià)值。超濾最合適用于蛋白的濃縮，更換緩沖液和除鹽，對(duì)于按照分子量進(jìn)行初分離的效果不是很好，理論和現(xiàn)實(shí)是有很大差別的_關(guān)于Western Blot 1）器具的清潔非常重要，開(kāi)始做前，為了安全，尤其是裝膠的厚薄玻璃板，可以先用中性洗滌劑和自來(lái)水反復(fù)沖洗，確保無(wú)洗滌殘液后用蒸餾水沖洗 23 遍，然后用去離子水沖洗一遍。最后用 95再擦一遍后晾干備用。2）配膠最好現(xiàn)用現(xiàn)配，先配下層膠（分離膠），后配上層膠（濃縮膠或積層膠），而且在臨灌膠前加 APS 并迅速混勻，即用移

13、液槍抽吸與注入 12 次即可。17 跑蛋白page 的時(shí)候，一開(kāi)始用加樣針，太麻煩，發(fā)現(xiàn)用 20ul 槍+普通槍頭點(diǎn)，非常省事。另外，點(diǎn)樣時(shí)有可能看不清孔在哪，看遠(yuǎn)離你的那面膠，反光的。點(diǎn)樣也點(diǎn)你對(duì)面的那塊膠，省的總低頭，干咱這行的容易得頸椎呀，愛(ài)惜自己。18. 垂直電泳時(shí)，可在電泳糟中放入青霉素小瓶等，可自然使液面提高而不影響電泳，又很節(jié)約電泳緩沖液。19.有時(shí)要沉淀東西時(shí)，由于沉淀量很少，離心完之后不知道到底有沒(méi)沉淀下來(lái)東西，由于量很少，不好觀察，所以離心時(shí)建議按特定的方向放置離心管，這樣你就可以在離心之前確定沉淀該沉淀到管子的大致部位，這樣離心后就可直接觀察那有沒(méi)有沉淀，避免滿管子找，另

14、外看沉淀時(shí)可以對(duì)光看，這樣就是顆粒狀的細(xì)小沉淀也能看見(jiàn)的。20. 大家都知道PMSF 有劇毒，以前都是知道濃度和要配的體積的基礎(chǔ)上,算出要稱多少毫克的PMSF,其實(shí)也可以先稱PMSF,稱多少算多少,再調(diào)整異丙醇的體積，到達(dá)你所要的濃度。這樣就避免了你長(zhǎng)時(shí)間和它接觸。21. 跑好SDS膠的一些體會(huì)。1.好玻璃板，不要偷懶，很多時(shí)候跑完電泳撬膠時(shí)會(huì)因?yàn)椴ＡО宀桓蓛裟z粘在板上把膠撬破。2. 配膠時(shí)不要反復(fù)用槍混，稍微搖混就可以了，用槍混多次會(huì)導(dǎo)致膠凝不好影響電泳圖的分辨率。AP 分裝成 500 微升一管保存放-20 度，避免 AP 用太久失效。倒膠時(shí)把玻璃板中的水用濾紙盡量吸干，因?yàn)槲⒘康乃嬖跁?huì)影

15、響配的膠濃度。盡量不用過(guò)夜放室溫或者四度的膠，也回影響膠 的分離效果。電泳完撬膠時(shí)根本不需要用撬膠板，在一平皿里裝好水，把有膠一面的放在水中晃動(dòng)幾次膠很容易就脫落下來(lái)，一點(diǎn)沒(méi)有問(wèn)題，方便的很。點(diǎn)樣時(shí)樣品別忘了離心這步，因?yàn)樯蠘雍泄腆w沉淀會(huì)影響電泳圖分辨效果。盡量在冰浴狀態(tài)下跑。22. 做做的比較多，總結(jié)了幾個(gè)小竅門(mén)：一向電泳時(shí)，鹽離子容易聚在膠槽的兩側(cè)剪一小段膠條放在兩側(cè)，鹽橋，電壓就容易上去了避免一向電泳不好影響最后實(shí)驗(yàn)結(jié)果 SDSPAGE 時(shí),在灌膠之前,一般大家都會(huì)用凡士林封底, 在SDSPAGE電泳之前又必須把凡士林搽干凈,很是麻煩,經(jīng)驗(yàn)是:不用凡士林,取少量未加Ap 的分離膠,按比

16、例加2 倍量的 Ap,然后灌入板間,等上幾分鐘,待膠凝固后就可以接著灌分離膠了.方面,效果好!蛋白質(zhì)純化時(shí)，蛋白質(zhì)降解可能與超聲破菌保持冰浴有關(guān)，之前建議加 pmsf，建議在上柱子洗脫的時(shí)候也加pmsf（蛋白降解抑制劑），一定要用之前再加。做透析的時(shí)候，拿一個(gè) 5ml 的槍頭或者是其他類似的東西，剪短，穿過(guò)個(gè)塑料之類的面積比燒杯大東西，然后把透析帶一端扎緊，另一端開(kāi)口綁緊在5ml 槍頭下端，扎緊得那端也可以彎過(guò)來(lái)綁成 u 字型。這樣就可以用 1ml 的槍穿過(guò) 5ml 的槍頭的孔，另一只手調(diào)整透析帶，來(lái)加樣取樣，省去了總綁透析帶的麻煩，對(duì)同一個(gè)蛋白大量多次透析非常方便25. 第一次發(fā)貼說(shuō)一下自己

17、的小經(jīng)驗(yàn)，希望版主能給我一分，每次看到好東西因?yàn)闆](méi)分都沒(méi)法下，好羨慕有分的人啊。當(dāng)然也不能不勞而獲，說(shuō)一下自己的實(shí)驗(yàn)技巧給大家。1. 配SDS膠時(shí)，用槍頭混勻比較麻煩，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，效果也不好?？梢约粢恍《螉A文件的那種曲針做轉(zhuǎn)子放到配膠的小燒杯里，在磁力攪拌器上邊攪邊加入各溶液，這樣加完也就混勻了，直接灌膠即可。2. 上面的站友也，上樣用黃槍頭就行，我也一直在用，根本不用注射器，方便的很，建議大家也試試。3.電泳后考馬斯亮藍(lán)染色一般要 1h 到 2h，脫色也要 2h 左右，麻煩的很?，F(xiàn)在給大家說(shuō)一個(gè)簡(jiǎn)單的方法，是我從一個(gè)師姐那里學(xué)到的。加入染色液后，先放入微波爐里加熱 5-10 秒，使染色液微

18、熱即可（千萬(wàn)不要加熱太久，否則冰醋酸就揮發(fā)了）。然后放水平搖搖 20 分鐘，最多就染好了。脫色也很簡(jiǎn)單，不用脫色液，直接用去離子水，放微波爐里煮沸 5 分鐘左右，然后將水倒掉，上新的去離子水煮，這樣反復(fù)幾次，就可以了。效果可能比正常的脫色稍差一點(diǎn)點(diǎn)，不如那樣清楚，只要電泳時(shí)比平時(shí)多上 1/5 的樣品就可以了，關(guān)鍵是這樣省時(shí)省材料（用不著含甲醇和冰醋酸的脫色液）。方便快捷！放心，反復(fù)煮膠不會(huì)把膠煮壞的。26. 我也說(shuō)說(shuō)小經(jīng)驗(yàn)?？赡艽蠹叶贾?，請(qǐng)別笑話我。1、配膠時(shí)一定要掌握好時(shí)間，不要因?yàn)檫^(guò)度趕時(shí)間，而造成以后的條帶粗大，壓不成條帶，且消耗很多試劑和時(shí)間。2、加樣時(shí)，沖洗加樣器可許是因?yàn)镾DS

19、的原因吧？蒸水，用電泳液會(huì)使加樣器中有很多的?；?、對(duì)于大分子蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜過(guò)夜更好。濾紙的可以適當(dāng)減少。4、在跑樣時(shí)同時(shí)加入 MARKER 有助于正確識(shí)別所需的蛋白位置，減少 NC 膜的消耗。5、一抗、二抗的濃度不要太高。6、做 ECL 顯影時(shí)，根據(jù)熒光的亮度調(diào)整時(shí)間。泡完顯影液，膠片應(yīng)用水洗一下，以減少定影液變黃。7、和有經(jīng)驗(yàn)的同學(xué)交流，也是非常重要的。知識(shí)的交流絕對(duì)有助于試驗(yàn)的成功。這是我目前的一點(diǎn)拙見(jiàn)。27.一個(gè)省質(zhì)粒試劑盒硅與溶液的方法：所有試劑使用手提質(zhì)粒自己配置的溶液一、溶液二、溶液三（代替試劑盒的solution1、2、3），然后一比一的與飽和碘化鉀或碘化鈉（代替結(jié)合緩沖液）混合

20、，就可以讓質(zhì)粒在硅膠上結(jié)合，而試劑盒的硅可以重復(fù)使用，沒(méi)有試劑盒溶液量的限制，只要是一樣的質(zhì)粒提幾管就提多少。順便說(shuō)一句硅也可以用自己買(mǎi)的硅膠粉末代替，離心后倒掉硅上面的上清就可以，用起來(lái)不象柱子方便。效果比手提的要好要快。28. 做 WB 時(shí),樣品比較多, 又怕放時(shí)間長(zhǎng)了對(duì)蛋白樣品不好,而且確定以后肯定要做某個(gè)抗體,只是一時(shí)沒(méi)有決定.那么你可以選擇先做SDS,并轉(zhuǎn)膜. 然后把PVDF 膜涼干, 放四度保存. 以后拿出來(lái)封閉后,加抗體就行了. 蛋白在膜上,且已經(jīng)分離, 比保存在BUFFER 里面的蛋白肯定更可靠。呵呵29. 今天作his 純化的時(shí)候，又琢磨了一個(gè)竅門(mén)，與大家。我得樣品比較多，幾

21、百ml，而柱子不夠大，只有 10 幾ml，跑來(lái)跑去的上樣，還總得記著，太麻煩了。于是，我就刷干凈了一個(gè)燒杯，裝了樣品，找了一個(gè)細(xì)膠皮管，當(dāng)連通器，就像魚(yú)缸換水一樣，用 5ml 槍在一頭一吸，液體流出來(lái)，放到純化柱里，調(diào)好燒杯的位置，兩個(gè)液面一樣平了，呵呵，上了好幾個(gè)小時(shí)了，沒(méi)有問(wèn)題，現(xiàn)在調(diào)低速度，過(guò)夜上樣：）30. 能導(dǎo)致PAGE 膠不凝的原因主要有三個(gè)：1、配膠中用到的主要試劑的配置。主要就是 30的酰胺的配置。粉末狀的酰胺和甲叉酰胺使用不應(yīng)該超過(guò)一年，因?yàn)轷０窌?huì)吸潮水解，這樣以來(lái)丙烯酸的含量就會(huì)加大，從而導(dǎo)致page 膠不凝。2、溫度。溫度高時(shí)凝固快，但是亦不宜過(guò)高，因?yàn)闇囟茸兓瘯?huì)影響交連

22、物的孔徑大小。所以溫度在 25 度最為合適。3、氧氣。氧氣是凝固的終止劑，所以不能讓膠中出現(xiàn)氣泡。雖然都是些看起來(lái)聽(tīng)低級(jí)的錯(cuò)誤，但是不注意還是會(huì)犯。31. 我做 2 維蛋白電泳，也有些心得：1、向電泳玻璃板內(nèi)加入膠條時(shí)，先在縫隙中加入配好的溴芬蘭緩沖液，要加滿，再將膠條貼后面玻璃板壁用薄片將膠條緩緩?fù)葡轮聊z上緣，這樣可以很好的避免膠條下形成空氣泡。2、能做出好的圖譜已經(jīng)很不容易了，如果在掃圖時(shí)撕破實(shí)在可惜，所以掃圖要，將凝膠轉(zhuǎn)移到掃描儀時(shí)可以用隔片在下面托著，同時(shí)保持有些水，這樣就安全多了。32. 湊個(gè)熱鬧吧1、sds膠如果配好裝好倒入內(nèi)槽液以后，發(fā)現(xiàn)內(nèi)槽液稍有滲漏，可以把外槽液多加一些，加

23、滿，加到與內(nèi)槽液相齊，這樣就可以繼續(xù)正常跑膠，不用浪費(fèi)已經(jīng)加進(jìn)去的內(nèi)槽液2、至于染色脫色，這里一直是染色：加熱半分鐘，搖 20 分鐘；如果染液不是新配的，就加熱半分鐘搖十分鐘，涼透了再重復(fù)一次即可脫色也一直是用去離子水煮兩三次即可3、不知道大家都是怎么做酶切的，體會(huì)是，酶切質(zhì)粒時(shí)，兩個(gè)酶分別單酶切比直接雙酶切效果要好很多。我有一次雙酶切兩次都沒(méi)連出來(lái)，后來(lái)分步單酶切，連接效率幾乎 100%?？梢缘谝粋€(gè)酶切完后直接把體系熱失活，（根據(jù)酶說(shuō)明書(shū)上一般是 65 度 20min）然后直接向里面補(bǔ)第二個(gè)酶或者第一個(gè)切完后用氯仿抽提，把蛋白提出或者中間做一次回收，這個(gè)就要考慮回收效率和損失了，但是這樣除蛋

24、白最徹底前兩個(gè)方法這都是有人做過(guò)的，已經(jīng)都很好用了33. 俺也來(lái)說(shuō)說(shuō)關(guān)于Bradford 法蛋白濃度定量和DTNB 法巰基濃度定量的一點(diǎn)體會(huì)：我是做蛋白修飾巰基后，通過(guò)這兩種方法的定量來(lái)間接反應(yīng)修飾的程度。一路摸索過(guò)來(lái)，也有半年有余；最大的體會(huì)就是不要急于求成，直接實(shí)驗(yàn)，首先檢測(cè)修飾體系是否對(duì)方法有影響，修飾基團(tuán)是否會(huì)在 595nm 和 412nm 下有特定的吸收，修飾后修飾試劑本身是否會(huì)有變化，對(duì)蛋白整體結(jié)構(gòu)造成影響，其次再談具體修Biochem. 1998 Dec飾比例和程度。對(duì)于巰基濃度測(cè)定方法，有四種（1;265(1):8-14），而 DTNB 本身雖然靈敏度不高，但是重復(fù)性和了。是最

25、佳的34. 考馬斯亮藍(lán)染色后的脫色，如在脫色液中加數(shù)張捏成條狀的 Kimwipes 紙（國(guó)外常用，相當(dāng)?shù)牟羚R紙，全棉制造），由于吸附到紙上，脫色加速。待紙較深時(shí)，更換新紙條，不用換液。脫脂棉或紗布也是一樣的。但濾紙等可能，會(huì)溶掉。半貼壁細(xì)胞如SP/0 或雜交瘤細(xì)胞傳代時(shí)，不用吹打或刮落。先將上清吸出，適當(dāng)拍打培養(yǎng)瓶（當(dāng)然是瓶，玻璃瓶拍碎了別找我），即可見(jiàn)貼壁細(xì)胞脫落，加培養(yǎng)基混懸即可。注意，過(guò)力拍打培養(yǎng)瓶會(huì)裂，特別是瓶頸。35. 一向電泳時(shí)，鹽離子容易聚在膠槽的兩側(cè)剪一小段膠條放在兩側(cè)，鹽橋，電壓就容易上去了避免一向電泳不好影響最后實(shí)驗(yàn)結(jié)果36. 我也幾條：1、關(guān)于 20021108 戰(zhàn)友的說(shuō)

26、法，我覺(jué)得好了一批感受態(tài)，最好馬上轉(zhuǎn)化一種已知質(zhì)粒，與此同時(shí)，取一點(diǎn)感受態(tài)接種到含抗性的固/液體培養(yǎng)基培養(yǎng)來(lái)做對(duì)照。這樣第二天即可以知道這批感受態(tài)是否還有外源質(zhì)粒，又可以知道這批感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率的高低。如果合格，那以后就可以放心使用！因?yàn)槲乙苍?jīng)遇到其實(shí)是因?yàn)楦惺軕B(tài)不好而導(dǎo)致試驗(yàn)不成功，但是當(dāng)時(shí)不知道，結(jié)果費(fèi)時(shí)費(fèi)力。2、做克隆挑斑時(shí)，可以在將沾有菌體的牙簽丟到試管前，在一塊相應(yīng)抗性的平板上點(diǎn)一下，標(biāo)注清楚，培養(yǎng)時(shí)間稍長(zhǎng)一點(diǎn)，待長(zhǎng)成較大菌收取。以后需要哪一個(gè)菌,就在平板上挑取。這樣既方便快捷，又可以保證菌的一致。3、抽提質(zhì)粒時(shí)，加入Sloutio和III 后要求輕柔混勻。我個(gè)人覺(jué)得不用這樣，只要不

27、是非常劇烈，可以快速混勻。尤其可以運(yùn)用在一次抽提多管質(zhì)粒的時(shí)候，這樣可以快速，而且效果一點(diǎn)也不差。4、抽提質(zhì)粒時(shí)，用無(wú)水乙醇沉淀的時(shí)間可以由實(shí)驗(yàn)操作者來(lái)決定，如果時(shí)間充?？梢?30min，否則 8-10min 也可以。至于溫度，個(gè)人覺(jué)得-20 度好于常溫。如果加入可醋酸鈉，會(huì)較容易形成鹽類雜質(zhì)，所以時(shí)間短一些更好！今天想到這些，先寫(xiě)到這里，以后想到了在上來(lái)與大家。希望小經(jīng)驗(yàn)對(duì)大家有所幫助！37. 首先：實(shí)驗(yàn)中的一些技巧要用在首先對(duì)基本的操作有深刻了解的基礎(chǔ)上，在力求省時(shí)、省力、節(jié)約成本等的同時(shí)，實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性是最重要的。對(duì)大多數(shù)做蛋白的戰(zhàn)友們來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)該是不陌生的，我這里談一個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞的小

28、技巧，大家知道，對(duì)于一定的空間（如某種尺寸的細(xì)胞培養(yǎng)瓶）來(lái)說(shuō)，細(xì)胞數(shù)目太多或者太少都不利于其生長(zhǎng)，太多了就要消化，太少了要換一個(gè)小點(diǎn)兒的培養(yǎng)瓶，做法是：如果細(xì)胞數(shù)目太少，可以不必去找小一點(diǎn)兒的培養(yǎng)瓶，可把原來(lái)的培養(yǎng)瓶由原來(lái)的平放改為豎著放，這樣底部的空間就小了，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞數(shù)目增加到一定程度的時(shí)候還可以在平過(guò)來(lái)，避免了來(lái)回?fù)Q培養(yǎng)瓶而增加污染的機(jī)會(huì)（對(duì)沒(méi)有小培養(yǎng)瓶的更實(shí)用）。個(gè)會(huì)，參考。38. 說(shuō)說(shuō)關(guān)于SDS的幾個(gè)小經(jīng)驗(yàn)1、做好膠后，把所有的加樣孔都加上樣，這樣可以防止邊緣的樣品脫尾。2、高電壓/高電流電泳時(shí)，可以把電泳槽放到 41hr 搞定。箱中進(jìn)行電泳，省時(shí)省力，3、膠考染時(shí)間

29、40min，放在凝膠搖（沒(méi)有膠床可以放到 28 度普通搖，但要控制好搖床速度）緩緩搖動(dòng)，使染色均勻，同時(shí)可提高檢測(cè)的靈敏度，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)可以達(dá)到銀染的級(jí)別，就是脫色時(shí)間比較長(zhǎng)，一般需要脫色 23d，夏天的時(shí)候要勤換脫色液，防止變臭哦39. 質(zhì)粒小提如果是用作鑒定或酶切，不必進(jìn)行酚仿抽提，將溶液 1.2.3 離心后的清液移入一個(gè)新的 1.5ml 離心管中，再次離心 3-5 分鐘，取出上清液后，直接沉淀，不必?fù)?dān)心 DNA 切不開(kāi)，我已經(jīng)這樣使用一年多，沒(méi)出過(guò)什么問(wèn)題。當(dāng)然這樣的質(zhì)粒不很干凈，但是做鑒定足夠了。尤其是女同胞們，可以減少酚仿的，而且節(jié)省時(shí)間。分子生物學(xué)當(dāng)中的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)及技巧copy(2009

30、-03-23 15:02:08)大家平時(shí)做實(shí)驗(yàn)，肯定都有很多小的技巧，在書(shū)上都看不到的，也沒(méi)有系統(tǒng)的整理，但是確實(shí)能夠起到很好的作用，不妨在這里與大家一下。任何專業(yè)任何點(diǎn)滴的東西都行，也許就對(duì)別人有一點(diǎn)好處哦！舉個(gè)例子：我在用酶標(biāo)板加樣的時(shí)候，蛋白樣品常常會(huì)產(chǎn)生很多氣泡，如果做熒光實(shí)驗(yàn)，由于靈敏度非常高，一點(diǎn)點(diǎn)微小的氣泡都會(huì)影響很大，常常又不可能加消泡劑，我就用衛(wèi)生紙，撕下來(lái)一下條，搓成小針，碰一碰氣泡就破了，很好使：）1、酶切或者PCR 體系混合好以后，大家都會(huì)用手指輕彈EP 管的底部來(lái)混勻溶液，常常出現(xiàn)很多氣泡。這時(shí)候輕彈液面上方的管壁，消除氣泡就輕而易舉了。千萬(wàn)別彈液面下方的，氣泡會(huì)越來(lái)

31、越多。2、CR 不要一次做太多樣品 有時(shí)候機(jī)器不穩(wěn)定 影響結(jié)果3、用衛(wèi)生紙是一個(gè)，我覺(jué)得最好的是用接種針燒熱了之后去戳一下，防止被衛(wèi)生紙污染哈建議瞬間離心一下是最好的，不但消除氣泡，還有將管壁上的液體離下來(lái)，否則可能不夠分裝4、衛(wèi)生紙主要成分是素，一般并不會(huì)污染樣品，除非你做分析實(shí)驗(yàn)，之所以用衛(wèi)生紙是因?yàn)樗鼤?huì)吸水，減少水的表面張力，很容易就讓氣泡破裂了5、磁珠回收時(shí)，不要貪多，收集上層即可，太過(guò)影響 DNA 的純度和質(zhì)量，對(duì)、轉(zhuǎn)化有影像。6、各種buffer 都要完全融化后才能用，而且不管什么藥品，如果只剩下最后一點(diǎn)底子了，最好放棄，因?yàn)榭赡軙?huì)影響你的實(shí)驗(yàn)7、動(dòng)手前，一定要思路清晰，盡量把要做

32、的事情列出來(lái)8、做前一定要在筆記上寫(xiě)上 1、2、3.，在按照筆記一步一步做，否則容易出錯(cuò)。9、要加的酶阿，dNTP，水啊之類的能分裝的話最好分裝好一點(diǎn)，萬(wàn)一污染的話就全完了10、實(shí)驗(yàn)前,列個(gè)表單,關(guān)鍵點(diǎn).避免出錯(cuò).這樣費(fèi)一點(diǎn)時(shí)間是值得的.不要太相信自己的.孤風(fēng)逐日：任何試劑反復(fù)凍融對(duì)其效率都有很大地影響。所以買(mǎi)來(lái)的試劑第一次使用時(shí)要注意按每次實(shí)驗(yàn)用量分裝保存。提取的模板或純化的樣品也最好分裝保存，以備不測(cè)。很多個(gè)人經(jīng)驗(yàn)在個(gè)板塊相關(guān)分析中都有一些提及，只要多加留意就可以學(xué)到很多高手的不傳經(jīng)驗(yàn)。11、同時(shí)做很多管PCR 時(shí)的加樣技巧例如，需要做n 管PCR：1. 如果用同一對(duì)引物擴(kuò)不同的模板，可以

33、先按照事先確定的比例，按照 n+2的量把水，反應(yīng)緩沖液，dNTP，鎂鹽，引物和Tag 酶先加到一個(gè)大管里面，混勻后就是“預(yù)混合液”了，然后把“預(yù)混合液”分裝到做PCR 用的小管里面，通常我會(huì)分裝n+1 管，最后向前 n 管里面入模板，混勻，最后一管不加模板而是加入和模板等量的無(wú)菌水，作為對(duì)照，以檢查加樣過(guò)是否引入了污染，接下來(lái)就可以進(jìn)行PCR 反應(yīng)。2.如果用不同的引物擴(kuò)同一模板（不做多重 PCR），則將第 1 點(diǎn)的引物和模板次序調(diào)換即可。3.同理，如果用不同的引物分別擴(kuò)不同的模板，則將引物和模板留在最后分裝后再分別加入。這樣做的優(yōu)點(diǎn)：可以大量減少取樣次數(shù)，減少了不同 PCR 管之間的誤差（這

34、一點(diǎn)對(duì)于熒光定量PCR 尤其重要）；節(jié)省時(shí)間。缺點(diǎn)：如果在預(yù)混合液時(shí)的任何一步引入了污染則會(huì)導(dǎo)致這一批次的所有PCR 反應(yīng)都被污染，所以檢測(cè)是否被污染。次都做一個(gè)對(duì)照（用無(wú)菌水替換模板），以12、如果遇到試驗(yàn)有很多步，只是自己看protocol 做，沒(méi)有人帶而且是第一次，我建議確立好步驟，然后每做一步的時(shí)候只注重眼前這一步，認(rèn)真的做，不出錯(cuò)。這樣每一步都只是關(guān)心眼下，可以集中精力，并且每一步都保證無(wú)誤，最后結(jié)果應(yīng)該不會(huì)太壞，而且即使出了問(wèn)題，可以排除操作的。13、跑PAGE 膠染色的技巧吧：的親身體會(huì)，大家都知道如果嚴(yán)格按照 protocol 上的去做不但浪費(fèi)其實(shí)是藥品，也浪費(fèi)時(shí)間，程序還繁瑣

35、，當(dāng)然代價(jià)也高些。1、如果你跑的是小板的（SSR 之類的分析足夠），那么先找來(lái) 4 個(gè) 1 升左右的空瓶，洗干凈（我用的是國(guó)藥的裝尿素瓶，帶蓋的），用來(lái)分別裝銀染要用的固定液、染色液（硝酸銀）、顯影液、純水，在每個(gè)上面分別寫(xiě)上名字，以免弄錯(cuò)，每次回收這些溶液后，把蓋子擰緊，以一些揮發(fā)或分解吧，延長(zhǎng)使用“”。2、一般的書(shū)上都說(shuō)顯影液只能用一次，其實(shí)完全不至，我一般都是至少用 2 次，根本一點(diǎn)問(wèn)題都沒(méi)有。還有固定液和染色液也可以適當(dāng)多用幾次，只要能然出來(lái)就行。3、有的時(shí)候用超純水 so 多，也so 浪費(fèi)，或是一時(shí)半會(huì)制不出來(lái)，而染色要用怎么辦呢，我無(wú)意中就用蒸餾水代替，什么問(wèn)題都沒(méi)有，根本沒(méi)啥差別

36、，甚至于后來(lái)我壓根都不用蒸餾水了，干脆改自來(lái)水，也沒(méi)啥問(wèn)題，完全可行，不信大家可以試試，呵呵，雖然說(shuō)是可能某些地方不是很合理，但對(duì)一般像做分子標(biāo)記之類的根本沒(méi)啥影響，替能省就省點(diǎn)吧，大家都不容易，哈哈!還有我忘了說(shuō)了，以前經(jīng)常跑完膠后來(lái)不及染色就得回寢室了，怎么辦呢，不用熬夜，就把膠剝離下來(lái)泡在固定液里，第二天早上再來(lái)接著下面的步驟一點(diǎn)問(wèn)題都沒(méi)有，就是可能膠尺寸會(huì)有些變化，但絕對(duì)不影響你的結(jié)果。“發(fā)明”了一種實(shí)用、最后一個(gè)就是讀帶問(wèn)題，我見(jiàn)過(guò)別人好多種方法，但準(zhǔn)確的：找一塊大點(diǎn)的普通玻璃板(我當(dāng)時(shí)用的是跑大垂直板膠的），帶上手套（保護(hù)好自己，雖然聚合后毒性小，但還是有的），快速把膠撈出來(lái)，放在玻璃板上，再迅速把玻璃翻個(gè)面，平放在觀片燈上，只要你速度快，膠是不會(huì)掉下來(lái)的，會(huì)緊緊貼在玻璃上的，最好玻璃板和管片燈的平面有點(diǎn)空隙，否則膠粘住觀片燈表面就會(huì)把燈面弄臟，膠也可能會(huì)掉，一切弄好后，你就可以直接那筆在玻璃的這個(gè)干凈面上一清二楚的讀帶，直接可以往上面寫(xiě)帶型，然后為了以后檢查用，最好用數(shù)碼相機(jī)快速拍照保存，不但膠上的帶可以看清，你在玻璃上寫(xiě)的帶型數(shù)字也是非常清楚的，當(dāng)然讀完的膠就可以立即扔掉，沒(méi)必要保存14、做實(shí)驗(yàn)時(shí)，認(rèn)真做好新，寫(xiě)好實(shí)驗(yàn)結(jié)果，過(guò)一段時(shí)間再去看看，溫故而知15、有些時(shí)候做完，由于條帶很淡，但你想回收不妨將有目的條帶的膠切下來(lái)放到度凍