分子克隆詳細(xì)步驟

1、分子克隆步驟：一、貼壁細(xì)胞總RNA提?。?、吸掉培養(yǎng)液，用PBS洗一遍？2、往培養(yǎng)皿中加入1ml,TRIzol,吹打幾次（每10cm2面積，即3.5cm直徑的培養(yǎng)板加1ml）3、移至1.5mlEP管，靜置5分鐘4、加入200ul三氯甲烷，震蕩混勻，室溫靜置5分鐘5、4度12000r/min,離心15分鐘，取上清，約600ul6、加入500ul異丙醇，混勻后，靜置30分鐘？7、4度12000r/min,離心15分鐘，棄上清8、加入1ml70%預(yù)冷酒精洗滌沉淀物9、4度7500r/min,離心5分鐘10、棄上清，自然晾干11、加入50ulDEPC水溶解，測(cè)OD值鼠尾基因組DNA粗提?。?、100u

2、llysisbufferforeachtail,and2ul10mg/mlPK,55C,overnight.2、Then,100Cfor10mintodenaturethePK,use0.51ullysateastemplatetodoPCR.Lysisbuffer:(storeat4C)KCl0.5MTris0.1MNP-401%Tween-201%二、RT-PCR：1、預(yù)變性體系12ul：TOC o 1-5 h zTotalRNA2ulOligo(dT18)primer1ulDHwater9ul65C5min速置冰上2、RT體系：20ul：預(yù)變性體系12ul5xbuffer4ulRNAas

3、einhibiter1ul10mdNTP2ulMMLV1ul42C60min70C5min12Cforever3、PCR體系20ul：lOxbuffer10mdNTPPrimer(F+R)稀釋后cDNA(50ul)Pfuddwater2ul0.5ul1ul(0.5ul+0.5ul)1ul0.2ul15.3ul95C3min、(95C30s,55C30s,72C35s)x29cycle、72C10min、12Cforever三、跑膠鑒定PCR產(chǎn)物：四、醇沉PCR產(chǎn)物：1、將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管中2、加入0.1倍體積預(yù)冷NaAC,3倍體積70%預(yù)冷乙醇，混勻3、80C靜置30min4、

4、4度14000r/min,10min離心棄上清，加1ml70%預(yù)冷乙醇洗滌沉淀5、4度14000r/min,10min離心棄上清,自然晾干6、加入25-20ulddwater吹勻靜置10-20min待溶解五、原始質(zhì)粒/PCR醇沉產(chǎn)物雙酶切體系50ul：Enzyme1Enzyme210 xBuffer10 xBSATemplateADDddwaterto1ul1ul5ul(在體系中被稀釋成1x)5ul(看需要)1ug50ul酶切過夜？六、單獨(dú)鑒定質(zhì)粒酶切產(chǎn)物：1、采用20ul體系：酶各0.5ul、buffer2ul、bsa0.5ul、template2ul)酶切2h2、跑膠鑒定七、電泳，切膠回收

5、與純化：使用DNA回收試劑盒(QIAquickGelExtractionKitProtocol)PCR酶切產(chǎn)物純化：將PCR產(chǎn)物于需要的電壓和電流下跑電泳紫外燈下仔細(xì)切下含待回收DNA的凝膠，置1.5ml離心管中，稱重。加入BufferQG(每100mg凝膠加BufferQG300卩1),置50C水浴10min,每隔3,min渦旋一次至完全溶解，若回收片段小于500bp或大于4kb,則需加入異丙醇（每lOOmg凝膠加異丙醇100卩1）,混勻。加lOulNaAc調(diào)pH值（至7.5.）,混勻。若液體顏色同QG,則無需調(diào)pH值。將小柱放在2ml收集管上,將上述溶液加于柱上，靜置3分鐘，可分次做，每次

6、不超過800ul。4C離心12000rpmx1min,棄去收集管中液體。加入500卩1BufferQG于柱上，4C離心12000rpmx1min,棄去收集管中液體。加入750卩1BufferPE于柱上，靜置3min,4C離心12000rpmx1min,棄去收集管中液體。4C離心12000rpmx1min。棄去收集管?？罩x心？靜置20-30min。將柱放于一新1.5ml離心管上，加50卩1BufferEB或水于柱上。放置1min,4C離心179OOrpmx1min。測(cè)濃度，可取5卩1回收DNA電泳檢測(cè)鑒定。注意事項(xiàng)：紫外燈下切下含待回收DNA的凝膠時(shí)，要襯以干凈的塑料薄膜，使用無DNA污染的新

7、刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。載體純化：1、膠回收載體酶切產(chǎn)物，方法同PCR酶切產(chǎn)物膠回收。2、CIAP體系60ul：Vector50ulBuffer6ul（占1/10體系）Cip1ulddwater3ul混勻，37C90min3、進(jìn)一步純化：加入3倍與cip體系體積的BufferII,置50C水浴10min,每隔3,min渦旋一次。將小柱放在2ml收集管上，將上述溶液加于柱上，靜置3分鐘。4C離心12000rpmx1min,棄去收集管中液體。加入500ulwashsolution12000rpmx1min棄液體。再加入500ulwashsolution12000rpmx1min棄液體

8、?？罩x心12000rpmx30s將柱放于一新1.5ml離心管上，開蓋靜置20-30min,加50卩1BufferEB,50C水浴3分鐘。4C離心17900rpmx1min。測(cè)濃度。八、連接：體系20ul：2ul1ul0.03pmol0.090.3pmol20ul10 xDNALigaseBufferDNALigaseVectorInsertNuclease-freewatertoXC、Xhourslpmol的lOOObp大小的DNA片段質(zhì)量約為0.66ug即：66ngvector：insert=1:310九、感受態(tài)細(xì)胞涂板復(fù)蘇挑單克隆：十、單克隆搖菌擴(kuò)增：十、轉(zhuǎn)化、涂板（簡(jiǎn)略）：1、將5ul

9、連接產(chǎn)物加入到50此？感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴60分鐘。（-80C儲(chǔ)感受態(tài)需先手捂解凍后冰上放置10min）。2、把轉(zhuǎn)化管轉(zhuǎn)移至42C水浴鍋中，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)90s。3、把轉(zhuǎn)化管迅速轉(zhuǎn)移至冰上，2-3分鐘。4、向每個(gè)轉(zhuǎn)化管中加入800此？無抗LB培養(yǎng)基，37C搖床170rpm溫育60min。5、吸取lOOyL?涂布于含有相應(yīng)抗性的LB瓊脂平板上。6、倒置？平板培養(yǎng)37C溫箱過夜，轉(zhuǎn)化克隆應(yīng)該于12-16小時(shí)區(qū)間出現(xiàn)。十二、挑單克隆搖菌、搖菌：1、加入3ml含抗LB培養(yǎng)基于一新的搖菌管中。2、標(biāo)記單克隆，槍頭挑菌后放入搖菌管。3、37C、215rpm過夜。十三、手提質(zhì)粒：提質(zhì)粒前注意留種（850ul菌

10、液+150甘油，取200ul分裝至EP管）1、從剩余菌液中取1.5ml左右至新的EP管中，8000rpm離心沉淀23min棄上清。2、每管加100ulSolutionI重懸震蕩渦旋混勻。3、每管加200ulSolutionII輕柔混勻。4、每管加150ulSolutionIII輕柔混勻（果凍狀），速置冰上5min。5、4C13500rpm離心510min，回收上清液。6、轉(zhuǎn)移上清至新的EP管中，每管加300ul酚氯仿，4C13500rpm離心3min,回收上清至新EP管。7、每管加0.7倍體積異丙醇，渦旋混勻，RT靜置10min或20C靜置35min（不宜久，防鹽沉）。8、4C13500rpm

11、離心10min棄上清。9、每管加800ul70%Ethanol洗滌一遍。10、4C13500rpm離心10min棄上清，自然晾干。11、每管加3050ulddH2O。12、測(cè)濃度。Solution酉己方：減裂解溶液I（制備質(zhì)粒）50mnioi/L萄菴擁25nimoI/LTria-Cl（pII8.0）10nimd/LEDTA（pH8.0）晦液效町配制1血ml,很廣gM.05k/rrT?）國力下蘸賈滅韻詁mg保存干小癡裂解濬漉U（制備質(zhì)粒）0,2NMaOH丸WN芒與液中現(xiàn)出現(xiàn)第濯）1%（/V）SUS幣液T妥玫用理配制.重溫下使用、織性裂解溶液皿（制備痰粒）TOC o 1-5 h z5mol/L乙酸

12、鉀60,0ml冰乙戢（!?11,5nilH2O28.5ml所配成的槽液中鉀的SOJmd/Lt乙IMS的濯度為2心保存于4C*用時(shí)3tF冰浴中,十三、酶切后跑膠鑒定：十四、測(cè)序：十五、制作細(xì)菌超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞（分子克隆III）準(zhǔn)備】13巳轉(zhuǎn)化緩沖液（用前冰上預(yù)冷人耒囪配啊轉(zhuǎn)化;緩沖液的水的H機(jī)filft,會(huì)降低感受$細(xì)胞的轉(zhuǎn)花率。閔此，采用直按從質(zhì)董很好白過濾歩斑（MUlue）取潯的水將會(huì)得創(chuàng)満盤的紡杲口國如出現(xiàn)問題，慎用前用活性敲赴理丄霧子水。a.0.5moi/L的PIPES（PH6.7）哌嗪N,N-雙（2-乙磺酸）洛液的配彳15.1gPIPES溶于80ml水中（M1&Q級(jí)，或與之相當(dāng)級(jí)別的人5

13、mol/I調(diào)pH值至6人最后加純水，定容至100ml。用預(yù)先址理的N血鈉（0.45pmU徑）過淀除菌。分成小份于-20C保存。bInoue轉(zhuǎn)化緩沖液的配制匸將下列組分溶于800ml純水中，然后加20ml0.5nL的PIPES(pH6,7).加純水定容至1U試剤需ft/L鑿蔽度Mnlz-4OL0.88g55mmd/LCaCtrHiO2-20g15mrnol/LKC118*65.250mmol/LPIPES(0.5mol/UpH6.7)20ml10mmcl/LHjO補(bǔ)至IL挑取一個(gè)經(jīng)37V培養(yǎng)1620h平皿上的單菌落（23imn直徑人接種至250ml中的25mlLB培養(yǎng)液或SOB培養(yǎng)液中.371C

14、搖床（250-300r/min）培養(yǎng)681晚上約6點(diǎn)鐘，將上述初始培養(yǎng)物接種于三個(gè)盛有250mlSOB培養(yǎng)液的1L中，第一個(gè)IffllOml,第二個(gè)加4ml,第三個(gè)加2ml,于1822匸中速搖床d次日早上，測(cè)量三瓶培養(yǎng)物的OD血值，每45min測(cè)定一次。5*當(dāng)有一瓶的培養(yǎng)物ODkiooOJS時(shí)，將培養(yǎng)瓶置于冰上10min（棄去男兩瓶襄由于大多冥驗(yàn)室的晝夜溫差粒大，而且浪聲也隨一年四季及工作人風(fēng)數(shù)的變化曲變化。Ert.:合1300值的時(shí)期.尤其是魄上。同時(shí)培養(yǎng)三瓶不同液度橈度的罄氧可以提高脫功的機(jī)會(huì)，培養(yǎng)述至少有一瓶是符合要求的。6于41C以25QQg（相當(dāng)于SorallGSA轉(zhuǎn)頭3900r/m

15、in）離心10min收集菌卡働去培養(yǎng)液.將離心管倒扣在吸水紙上2min以吸干剩余液體，用一個(gè)真空將貼附在管壁上的培養(yǎng)基吸干。加80ml預(yù)冷的Inog轉(zhuǎn)化緩沖臧東懸細(xì)菌淀“輕輕誕轉(zhuǎn)，不要用援茜饗或歐吸海勻。0豐4rXHAiyfiH出干Jill妹辿aonn從倉心1Hminifr僅蘆儲(chǔ)L凍存感受態(tài)細(xì)胞H用20ml預(yù)冷的Inoue轉(zhuǎn)化緩沖液輕輕重懸沉淀。12.加1.5mlDMSOo輕輕混勻細(xì)苗懸液，放置冰上10mix13迅速將懸液分裝到冷卻的無菌微量離心管中，封緊管口，沒入波氮中快速冰?!態(tài)細(xì)胞。It存于-70C備用。闿就氨at凍可戲揚(yáng)猶轉(zhuǎn)化效率約$倍。就大方面的同途來說.的川葛壘盍細(xì)聽?wèi)v袱已轉(zhuǎn)井打余

16、了耕而，JUWSM大董的串（如村建cDNA文庫人每水份感受3S細(xì)胞的盤可HBWRtaX*.14,需要時(shí)從-70V冰箱中取出一管感受杰細(xì)胞，把管握于手心，融化細(xì)胞一經(jīng)融化，立即把管轉(zhuǎn)移至冰浴中，住冰上放置10mino15-用一冷的無菌吸頭把感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到冷卻的無前聚丙烯管（17x170mm）置在冰浴上。不用StWUAH為它幻參降抵轎化戲率約10倍轉(zhuǎn)化包括陽性和陰性對(duì)照（請(qǐng)見方案23中的專欄斛細(xì)菌轉(zhuǎn)化J16,將要轉(zhuǎn)化的DNA片段加入到裝有感受態(tài)細(xì)胞的管中（50川感受態(tài)i25ngDNA）t體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞的5%,輕輕旋轉(zhuǎn)幾次混勻內(nèi)容物。至少設(shè)對(duì)照管：一個(gè)含有感受態(tài)細(xì)胞和已知呈的超螺旋質(zhì)粒DN

17、A,另一管受態(tài)細(xì)胞?；靹騼?nèi)容物，冰浴30mim17.將管放入預(yù)加溫至42匸的循環(huán)水浴中.恰恰放置90策不要搖動(dòng)o鶴藏是一6關(guān)鍵步驟.準(zhǔn)確炮達(dá)到熱湛輕度非常垂3L這墾的証度及現(xiàn)會(huì)的莊聞都是便用升血的測(cè)蚩參數(shù)，其他類型的管將町賽獲得不閒的8*.19.每管加800川SOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫至37V,然后將管轉(zhuǎn)移到18快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻12mi%將適當(dāng)體積每個(gè)90mm平板達(dá)200Ml）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含20nMgSO4和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)墓上。如果用四環(huán)素作為選擇標(biāo)記.全梆的轉(zhuǎn)化混合物可以備在一個(gè)單獨(dú)的平凰上或軟瓊膳中），可!量離心機(jī)上室趕離心扯以收與轉(zhuǎn)牝菌，輕拍臂墜

18、的同時(shí)加入100卩1SOC璽懸沉淀。重要：璇璃鋪菌器先希在乙靜中浸泡*魅后在酒糯燈上灼燒待它涼至窒溫后*才可將轉(zhuǎn)花菌?充瓊脂板表面如檢査氮節(jié)靑毒素的琉悝，用轉(zhuǎn)化菌舗平頊時(shí)密度戰(zhàn)較低f毎亍BOroin平板不磴過I菖落人熔養(yǎng)的時(shí)間不為過20h*祗節(jié)靑構(gòu)素抗性的特化體可將*內(nèi)醸胺驚分腸到塔養(yǎng)基中，迅筆滅橋菌蔣J的骨序素。這憚*憾平板時(shí)密農(nóng)過離或堵養(yǎng)時(shí)何過長鄒會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)對(duì)素融療的衛(wèi)星曲帯。；養(yǎng)基中不用氨青驀素而用鍍節(jié)青毒素、試及輯抗生索釀度從60怒/訕翼奇到皿可決情1善.任不能很謹(jǐn)慢除之?？拱眹熐嗔闼骶Y的增加與平齟上所.扭的細(xì)圜數(shù)的增加并無統(tǒng)性比制關(guān)系,是囲為被抗生素殺死的細(xì)胞禪放生長抑制物噴的Wo將平板置于室溫直至液休被吸收臼倒置平皿，于37C培養(yǎng)，12-16h后可出現(xiàn)菌落住SB菌轉(zhuǎn)化在每一牛實(shí)驗(yàn)申應(yīng)設(shè)有陽咗時(shí)照，以帛計(jì)轉(zhuǎn)化囊率設(shè)立陰性對(duì)以消除可館的污羞找査尉可能戲失畋：K胃”龕轉(zhuǎn)化宴證申.必?zé)┰O(shè)立一份不加DNA只有感受態(tài)細(xì)胞的社黒管.而且獨(dú)立撼于一個(gè)含直適量抗土素的平板.壬常傭況下K應(yīng)該有克隆K岀.如采育下列情況.必匆引起直視在實(shí)臉中，爲(wèi)臨脊鈿