番茄黑斑病病原菌的鑒定及生物學(xué)特性研究

1、番茄黑斑病病原菌的鑒定及生物學(xué)特性研究番茄黑斑病是番茄常見的病害之一，此病是由半知菌亞門番茄鏈格孢真菌AlternariatatKe.eber侵染引起的，鏈格孢菌是茄科植物中危害較大的病害之一。該病不僅發(fā)生在田間，更是采后貯藏過程中的重要病害，可侵染番茄、茄子、辣椒、馬鈴薯等茄科類蔬菜，主要通過氣孔、皮孔、傷口或表皮侵入果實，在適宜的條件下產(chǎn)生大量孢子，對果實造成嚴(yán)重危害1。研究說明，鏈格孢菌所產(chǎn)生的選擇性毒素對植物有致病性，對人體安康也有一定的影響1，所以研究鏈格孢菌的生長特性，探究鏈格孢菌在不同溫度、pH值、光照、碳源和氮源下的菌落長勢、直徑、菌絲生長速率、菌絲干質(zhì)量、產(chǎn)孢量的變化，可以探

2、明鏈格孢菌在不同條件下的生長趨勢。1材料與方法1.1試驗材料PDA固體培養(yǎng)基：200g馬鈴薯，20g瓊脂，20g葡萄糖，加水補足1000L。PA固體培養(yǎng)基：5g胰蛋白胨，2.5g酵母浸粉，1.0g葡萄糖，20g瓊脂，pH值為7，加水補足1000L。胡蘿卜固體培養(yǎng)基：將胡蘿卜去皮后稱取200g，20g瓊脂，加水補足1000L。番茄果肉固體培養(yǎng)基：200g番茄，20g瓊脂，加水補足1000L。V8果汁固體培養(yǎng)基：罐裝V8果汁200L，20g瓊脂，加水補足1000L。查彼zapek固體培養(yǎng)基：2gNaN3，1gK2HP4，0.5gKl，0.5ggS4，0.01gFeS4，30g蔗糖，20g瓊脂，加水

3、補足1000L。1.2試驗方法1.2.1病原菌的別離根據(jù)方仲達(dá)的方法2，對番茄發(fā)病處病原菌進(jìn)展別離，采用單孢子別離法獲得純化菌株，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)后保存?zhèn)溆?。生物學(xué)特性研究以所獲得的純化菌株tatb為供試菌株。1.2.2病原菌形態(tài)學(xué)鑒定將供試菌株在PDA培養(yǎng)基上活化，25恒溫培養(yǎng)6d后，用無菌水制成一定濃度的孢子懸液，同時觀察菌落顏色、大孝形狀及分生孢子的形態(tài)和顏色，從而進(jìn)展病原菌的鑒定。1.3生物學(xué)特性的研究1.3.1溫度對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響3用打孔器將菌體轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基上，分別置于1、4、15、25、28、30、37、40的培養(yǎng)箱內(nèi)，黑暗條件下培養(yǎng)7d，用十字穿插法測量菌落的

4、直徑，采用小室培養(yǎng)法，將孢子懸液滴于凹玻片上，置于以上條件下培養(yǎng)3、6、12h后，分別檢查孢子萌發(fā)率。使用棉藍(lán)乳酚油固定孢子懸液，鏡檢200個孢子，記下萌發(fā)的孢子數(shù)量，計算萌發(fā)率。每個處理3次重復(fù)。1.3.2pH值對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響用1l/L的Hl和NaH調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH值和孢子懸液的pH值為312。分別置于28恒溫、黑暗條件下和小室恒溫培養(yǎng)，觀察菌落直徑，計算孢子萌發(fā)率。1.3.3光照條件對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響將接入菌塊的PDA培養(yǎng)基和孢子懸浮液，分別在光暗周期為12h12h、完全光照和完全黑暗3種處理條件下，于28恒溫培養(yǎng)。觀察菌落直徑，計算孢子萌發(fā)率。1.3.4不同培養(yǎng)

5、基對菌株生長的影響分別以PDA、PA、番茄果肉固體培養(yǎng)基、V8果汁固體培養(yǎng)基和胡蘿卜固體培養(yǎng)基用打孔器將菌體轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基中心位置，置于28下恒溫培養(yǎng)7d，用十字穿插法測量菌落的直徑。每個樣品3次重復(fù)，計算平均值。1.3.5不同碳源和氮源對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響4選取D-木糖、D-果糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖和麥芽糖等量交換查彼培養(yǎng)基中的碳源蔗糖，使得各個不同碳源培養(yǎng)基中碳的含量一樣；用不加碳源的培養(yǎng)基作為對照。選取L-谷氨酸、天冬酰胺、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏等量替換查彼培養(yǎng)基中的氮源硝酸鈉，使得各個不同碳源培養(yǎng)基中氮的含量一樣；用不加氮源的培養(yǎng)基作為對照。將菌塊轉(zhuǎn)接到PDA固體平板中央，放

6、置在28恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，3、6d后用十字穿插法測量菌落的直徑，對照平行組計算出平均數(shù)，每組試驗重復(fù)3次。1.3.6光照對菌株生長和孢子萌發(fā)的影響將菌塊轉(zhuǎn)接到PDA固體培養(yǎng)基內(nèi)，分別在光暗周期為12h12h、完全光照全光和完全黑暗無光3種處理條件下，28恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；3、6d后測量菌落的直徑，對照平行組計算出平均數(shù)，每組試驗重復(fù)3次。將制備好的孢子懸浮液滴于凹玻片上，分別在光暗周期為12h12h、完全光照和完全黑暗3種處理條件下，28本文由論文聯(lián)盟.Ll.搜集整理的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，6、12h后測定孢子萌發(fā)率。1.3.7致死溫度確實定汲取1L孢子懸液至無菌試管中，分別置于4065以5為梯度

7、的恒溫水浴鍋中處理520in后迅速冷卻。將處理后的孢子懸液滴于凹玻片上，28小室培養(yǎng)，12h后觀察孢子萌發(fā)情況，測定孢子萌發(fā)率。2結(jié)果與分析2.1別離菌株的形態(tài)學(xué)觀察別離純化后獲得5株菌株，分別編號為tata、tatb、tat、tatd、tate，將這些菌株培養(yǎng)8d即可長滿整個培養(yǎng)皿，該菌的根本形態(tài)特征為：在PDA培養(yǎng)基上，菌落較為致密，呈絮狀平鋪生長，菌落最外層為灰白色，邊緣整齊，向內(nèi)為墨綠色，有較明晰的輪紋；分生孢子梗分隔，有橫縱隔膜，其中橫膈膜15個，縱隔膜03個，呈棕黃色，常多個呈鏈狀分布；單孢子短卵、橢圓或倒棍棒形圖1。根據(jù)該菌株的培養(yǎng)形狀及形態(tài)學(xué)特征，根據(jù)相關(guān)資料5-10，根據(jù)?真

8、菌鑒定手冊?的相關(guān)描繪11，初步鑒定為鏈格孢菌AlternariaalternateFr.Kiessler。2.2生物學(xué)特性2.2.1溫度對菌株生長和孢子萌發(fā)的影響由圖2可知，在4、15、25、28、30、37中均可生長，其中28為最正確生長溫度，培養(yǎng)3、6d后菌落平均直徑到達(dá)了30、50，菌落生長速度快，菌絲濃重茂密，顏色呈黑色，菌落邊緣整齊。當(dāng)溫度小于15或大于37時，菌落生長明顯受到抑制，菌絲變成灰白色，黑色孢子變少，菌落邊緣分辨不清，菌株有老化跡象；培養(yǎng)6d后菌落直徑均小于30。當(dāng)溫度為1、40時菌株不生長，也無萌發(fā)跡象。黑色鏈格孢分生孢子在437范圍內(nèi)均可萌發(fā)，其中4下培養(yǎng)6h萌發(fā)率

9、最低，為6.0%；28下培養(yǎng)12h萌發(fā)率最高，為97.6%。當(dāng)培養(yǎng)溫度小于15或大于37時，分生孢子萌發(fā)率明顯降低，培養(yǎng)12h萌發(fā)率均低于35.0%；當(dāng)溫度小于4或大于37時，分生孢子那么不能萌發(fā)。2.2.2pH值對菌株生長和孢子萌發(fā)的影響12由圖3可以看出，番茄黑色鏈格孢菌在pH值為312的PDA固體平板培養(yǎng)基中均可生長，當(dāng)pH值為6時，菌落生長速度最快；當(dāng)pH值小于4或大于9時，菌株生長明顯受到抑制。pH值為310時，培養(yǎng)12h后平均有62.2%的病原菌孢子可以萌發(fā)；pH值為7時，病原菌孢子萌發(fā)率最高，培養(yǎng)12h后萌發(fā)率為97.0%；當(dāng)pH值大于11時，孢子不能萌發(fā)。綜合考慮，菌絲生長和孢

10、子萌發(fā)的最適pH值選為6。2.2.3光照條件對菌株生長和孢子萌發(fā)的影響2.2.5不同碳源和氮源對菌株生長和孢子萌發(fā)的影響由圖4可以看出，致病菌在D-木糖、D-果糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖等7種不同碳源查彼固體平板培養(yǎng)基中均可正常生長，28培養(yǎng)3d后，菌落平均直徑在23.7538.00之間；培養(yǎng)6d后差異明顯，菌落平均直徑在37.5962.50之間。在供試的7種不同碳源培養(yǎng)基中，D-木糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖菌落平均生長直徑優(yōu)于其他培養(yǎng)基；其中，菌落生長狀況最正確的為添加乳糖的查彼固體平板培養(yǎng)基，28中培養(yǎng)6d后，菌落平均生長直徑到達(dá)62.50，菌落生長速度快，菌絲濃重茂密，顏色呈黑色

11、，菌落邊緣整齊；不加碳源的對照組那么不生長。試驗結(jié)果圖5說明，菌株在NaN3、天冬酰胺、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、L-谷氨酸等6種不同氮源查彼固體平板培養(yǎng)基中均可正常生長，28培養(yǎng)3d后，菌落平均直徑在250043.00之間；培養(yǎng)6d后差異明顯，菌落平均直徑在32.5065.50之間。在供試的6種不同碳源培養(yǎng)基中，NaN3、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏菌落平均生長直徑優(yōu)于其他2種培養(yǎng)基；其中菌落生長狀況最正確的為添加酵母膏的查彼固體平板培養(yǎng)基，28中培養(yǎng)6d后，菌落平均生長直徑到達(dá)65.50，菌落生長速度快，菌絲濃重茂密，顏色呈黑色，菌落邊緣整齊；天冬酰胺那么會抑制病原菌生長，28培養(yǎng)6d后，菌落平均

12、直徑低于40.00；不加氮源的對照組那么沒有生長。2.2.6致死溫度確實定試驗結(jié)果得出，供試菌株分生孢子在4045處理520in均可正常萌發(fā)；50處理20in時萌發(fā)率明顯降低，培養(yǎng)12h后平均萌發(fā)率只有11%，且菌絲生長受到影響；65處理15in后平均萌發(fā)率較50處理20in后更低，培養(yǎng)12h后平均萌發(fā)率只有3%；65處理2520KG*3in后，病原菌分生孢子不能萌發(fā)，由此可知，實驗室供試菌株的致死溫度為65處理20in，菌株有耐高溫屬性。3討論與結(jié)論重點對番茄鏈格孢菌的生長特性進(jìn)展研究，結(jié)果顯示，此菌對PDA固體平板培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)利用率較高，生長速度較快。致死溫度為65處理20in；菌株生長和孢子萌發(fā)的最適溫度為28；全黑暗培養(yǎng)下菌落生長速度最快，全黑暗下孢子萌發(fā)率最高。根據(jù)以上結(jié)論可知，此菌株生長特性與正常環(huán)境溫度、光照條件相似，所以可以在很短的時間內(nèi)侵染萌發(fā)、生長擴(kuò)展，與其耐高溫、不喜光、營養(yǎng)選擇上的特性一樣。該菌株愛好偏酸至中性的生長條件，與果肉和果實本身的pH值相近，與報道的病原菌一樣，菌株與