2022醫(yī)學(xué)課件動(dòng)植物細(xì)胞器離心法分離

1、實(shí)驗(yàn)4 動(dòng)植物細(xì)胞器別離、制備與觀察 I 線粒體制備與活性鑒定【目的】1掌握別離制備動(dòng)物和植物細(xì)胞線粒體的方法。2對(duì)別離得到的線粒體進(jìn)行活性鑒定。【原理】線粒體mitochondria是真核細(xì)胞特有的，司能量轉(zhuǎn)換的重要細(xì)胞器。細(xì)胞中的能源物質(zhì)脂肪、糖、局部氨基酸在此進(jìn)行最終的氧化，并通過(guò)藕聯(lián)磷酸化生成ATP，供給細(xì)胞生理活動(dòng)之需。第一頁(yè)，共二十六頁(yè)。將動(dòng)植物組織制成勻漿，在適當(dāng)?shù)膽腋〗橘|(zhì)中用差速離心法可以別離細(xì)胞線粒體。在一定的離心場(chǎng)中(選用離心機(jī)的一定轉(zhuǎn)速)，球心顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的黏度。在一均勻懸浮介質(zhì)中離心一定時(shí)間，組織勻漿中的各種細(xì)胞器及其他內(nèi)含物由于沉降速度

2、不同將停留在上下不同的位置。依次增加離心力和離心時(shí)間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。細(xì)胞器沉降先后順序是細(xì)胞核、線粒體、溶酶體和其他微體、核糖體和大分子。第二頁(yè)，共二十六頁(yè)。懸浮介質(zhì)通常采用緩沖的蔗糖溶液，它較接近細(xì)胞質(zhì)的分散相，在一定程度上能保持細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性；pH7.2的條件下；亞細(xì)胞組分不容易重新聚集成團(tuán)，有利于別離。整個(gè)操作過(guò)程樣品要保持在04，防止酶失活。第三頁(yè)，共二十六頁(yè)。細(xì)胞器標(biāo)記酶的測(cè)定是評(píng)價(jià)細(xì)胞器內(nèi)膜組分和別離純度的主要依據(jù)，如線粒體內(nèi)膜上分布有細(xì)胞色素氧化酶，該酶使詹納斯綠B染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍(lán)綠色從而使線粒體顯色，而胞質(zhì)中的

3、染料被復(fù)原成無(wú)色。第四頁(yè)，共二十六頁(yè)。詹納斯綠B是一種活體染料，能對(duì)動(dòng)、植物的細(xì)胞或組織在活體狀態(tài)下進(jìn)行無(wú)毒害的染色。由于染料(堿性染料)的膠粒外表帶有陽(yáng)離子，酸性染料的膠粒外表帶陰離子，而被染局部本身具有陰離子或陽(yáng)離子，這樣，它們彼此之間發(fā)生吸引作用，染料就被堆集下來(lái)。染色法可以顯示出活細(xì)胞內(nèi)的某種天然結(jié)構(gòu)存在的真實(shí)性，而不影響細(xì)胞的生命活動(dòng)和產(chǎn)生任何物理、化學(xué)變化以至引起細(xì)胞的死亡。第五頁(yè)，共二十六頁(yè)。鼠肝線粒體的別離【材料】鼠肝臟或豬肝臟?！緦?shí)驗(yàn)用品】1試劑：(1) 0.25 molL蔗糖+0.01 molL三羥甲基氨基甲烷(Tris)一鹽酸緩沖液(pH 7.4)： 0.1 molL三羥

4、甲基氨基甲烷溶液 10 mL 0.1 molL鹽酸 8.4 mL 加雙蒸水到100 mL，再加蔗糖使?jié)舛葹?.25 molL。(2) 0.34 molL蔗糖+0.01 molL Tris一鹽酸緩沖液(pH7.4)，配法同上。第六頁(yè)，共二十六頁(yè)。(3) 1詹納斯綠B(Janus green B)染液，稱取50 mg詹納斯綠B液溶于5mL生理鹽水中，稍微加熱使之溶解后，過(guò)濾，即為1原液。(4) 姬姆薩染液(Giemsa)： 稱取Giemsa粉0.5 g、甘油33 mL、純甲醇33 mL。先在Giemsa粉中加少量甘油，然后在研缽內(nèi)研磨至無(wú)顆粒狀，再將剩余甘油倒入混勻，56左右保溫2 h，使其充分溶

5、解，最后加甲醇混勻，成為Giemsa原液，保存于棕色瓶。使用時(shí)吸出少量用115molL磷酸緩沖液作1020倍稀釋。第七頁(yè)，共二十六頁(yè)。(5) 115 molL磷酸緩沖液 (pH 6.8)：115 molL磷酸二氫鉀(KH2PO4) 50 mL115 molL磷酸氫二鈉(Na2HPO4) 50 mL(6) 卡諾(Cornay)固定液： 無(wú)水乙醇 6 mL 冰醋酸 1 mL 氯 仿 3 mL(7) 生理鹽水第八頁(yè)，共二十六頁(yè)。2器具：解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃勻漿器，尼龍織物，刻度離心管，顯微鏡，冷凍高速離心機(jī)。第九頁(yè)，共二十六頁(yè)?！緦?shí)驗(yàn)步驟】1制備肝細(xì)胞勻漿：實(shí)驗(yàn)前將鼠空腹12小時(shí)，擊頭處死，剖腹

6、取肝，迅速用生理鹽水洗凈血水，用濾紙吸干水，稱取肝組織2 g，剪碎；用預(yù)冷的0.25 molL蔗糖溶液洗滌數(shù)次。然后按每克肝加4.5 mL預(yù)冷的0.25 molL蔗糖溶液的量，分?jǐn)?shù)次添加蔗糖溶液，在04冰浴中用玻璃勻漿器將肝制成勻漿，用雙層紗布過(guò)濾。第十頁(yè)，共二十六頁(yè)。2差速離心： 將0.34 molL蔗糖溶液4.5mL放入離心管，然后沿管壁小心地參加4.5mL鼠肝勻漿覆蓋于上層。用冷凍控溫的高速離心按以下圖順序進(jìn)行差速離心。第十一頁(yè)，共二十六頁(yè)。別離細(xì)胞核：鼠肝勻漿700g離心10 min 沉淀(細(xì)胞核及質(zhì)膜碎片) 上清液(1) 洗滌(0.25 molL預(yù)冷蔗糖溶液5 mL洗滌2次，每次10

7、00g離心15 min。 沉淀(細(xì)胞核及質(zhì)膜碎片) 上清液(2)與上清(1)合并第十二頁(yè)，共二十六頁(yè)。別離線粒體：混合上清液10000g離心10 min沉淀(線粒體) 上清液(棄去)洗滌加預(yù)冷的0.25 molL蔗糖溶液10 mL，10000g離心10 min沉淀(純化的線粒體) 上清液(棄去)第十三頁(yè)，共二十六頁(yè)。3活性鑒定： (1) 細(xì)胞核：取核沉淀1滴涂于載玻片，參加Carnoy固定液15 min，晾干。Giemsa染液染10 min，蒸餾水漂洗數(shù)秒，用濾紙吸干水、用顯微鏡(40)檢查，細(xì)胞核呈紫紅色，混雜的胞質(zhì)為淺藍(lán)色碎片。(2) 線粒體： 取線粒體沉淀滴在載玻片上，勿太密。滴加1詹鈉

8、斯綠溶液染液，10 min后用光學(xué)顯微鏡觀察，線粒體藍(lán)綠色，呈小棒狀或啞鈴狀。第十四頁(yè)，共二十六頁(yè)。玉米線粒體的別離從植物細(xì)胞別離線粒體，除了作線粒體功能測(cè)定外，在植物細(xì)胞遺傳工程中，常用于別離核外基因線粒體DNA等目的。別離線粒體的方法仍采用均勻介質(zhì)中的差速離心。介質(zhì)中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA整合二價(jià)陽(yáng)離子，Ca2除去后細(xì)胞間粘著解體，促使組織分散成單個(gè)細(xì)胞。牛血清白蛋白(BSA)能包在細(xì)胞外面，并作為競(jìng)爭(zhēng)性底物削弱蛋白酶的作用。第十五頁(yè)，共二十六頁(yè)?！静牧稀坑衩S化幼苗(水稻、高粱等幼苗均可)?！緦?shí)驗(yàn)用品】1試劑：1別離介質(zhì)：0.25mol/L蔗糖

9、，50mmol/L的Tris-鹽酸緩沖液(pH7.4)，3mmol/LEDTA，0.75mg/mL牛血清白蛋白(BSA)。 50mmol/L的Tris-Hcl緩沖液(pH7.4)配法：50mL0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液與42mL 0.1mol/L鹽酸混勻后，加水稀釋至100mL。第十六頁(yè)，共二十六頁(yè)。2保存液：0.3mol/L甘露醇(pH7.4)320次氯酸鈉(NaClO)溶液。41詹納斯綠B染液，用生理鹽水配制。2器材：溫箱、冰箱、紗布、瓷研缽、冷凍控溫高速離心機(jī)。第十七頁(yè)，共二十六頁(yè)?！緦?shí)驗(yàn)步驟】1玉米種子用20次氯酸鈉溶液浸泡10min消毒，清水沖洗30min，再浸

10、泡清水15h。將種子平鋪在放有濕紗布的盤內(nèi)，保持濕度，置溫箱28于暗處培育23d。待芽長(zhǎng)到12cm長(zhǎng)時(shí)剪下約15g，放041h。2加3倍體積別離介質(zhì)，在瓷研缽內(nèi)快速研磨成勻漿。3用多層紗布過(guò)濾，濾液經(jīng)700g離心10min。除去核和雜質(zhì)沉淀。4取上清液10000g離心10min，沉淀為線粒體。再同上離心洗滌一次。5沉淀為線粒體，可存于0.3mol/L甘露醇中。注意以上勻漿化及離心均控制在04進(jìn)行。6線粒體的觀察：取線粒體沉淀涂在清潔的載玻片上，不待干立即滴加1詹納斯綠B染色20min，放上蓋玻片，用顯微鏡觀察，線粒體是藍(lán)綠色圓形顆粒。第十八頁(yè)，共二十六頁(yè)?！颈揪眄氈繉?shí)驗(yàn)全過(guò)程要求在04進(jìn)行，

11、如果使用非冷凍控溫的離心機(jī)，一般只宜別離細(xì)胞核和線粒體，同時(shí)注意使樣品保持冷凍；盡可能充分破碎組織、縮短勻漿時(shí)間。整個(gè)別離過(guò)程不宜過(guò)長(zhǎng)。【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】繪制線粒體示意圖。第十九頁(yè)，共二十六頁(yè)。II 葉綠體的別離與熒光觀察【目的】 了解葉綠體別離的一般原理和方法，并熟悉應(yīng)用熒光顯微鏡方法觀察葉綠體熒光現(xiàn)象?！驹怼?葉綠體是植物細(xì)胞中較大的一種細(xì)胞器，能發(fā)生特有的能量轉(zhuǎn)換。利用低速離心機(jī)可以別離葉綠體，其別離在等滲溶液(035 molL氯化鈉或04 molL蔗糖溶液)中進(jìn)行，目的是為了防止?jié)B透壓的改變引起葉綠體的損傷。將勻漿液在1000 rmin離心，去除其中的組織殘?jiān)鸵恍┪幢黄扑榈耐暾?xì)胞，然后

12、，3000 rmin離心，可獲得沉淀的葉綠體(混有局部細(xì)胞核)。在室溫下進(jìn)行別離要迅速。第二十頁(yè)，共二十六頁(yè)。某些物質(zhì)在一定短波長(zhǎng)的光(如紫外光)的照射下吸收光能進(jìn)入激發(fā)態(tài)，從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，就能在極短的時(shí)間內(nèi)放射出比照射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光(如可見光)，這種光就稱為熒光。假設(shè)停止供能熒光現(xiàn)象立即停止。有些生物體內(nèi)的物質(zhì)受激發(fā)光照射后，可直接發(fā)出熒光(稱為自發(fā)熒光)，如葉綠素的火紅色熒光。有的生物材料本身不發(fā)熒光，但它吸收熒光染料后同樣也能發(fā)出熒光(稱為間接熒光)，如葉綠體吸附吖啶橙后可發(fā)橘紅色熒光。本實(shí)驗(yàn)利用熒光顯微鏡對(duì)發(fā)熒光的葉綠體進(jìn)行觀察。第二十一頁(yè)，共二十六頁(yè)?！静牧稀?菠萊葉片?！緦?shí)驗(yàn)用

13、品】1試劑：蒸餾水，0.35 molL氯化鈉溶液，0.01吖啶橙。2器材：普通離心機(jī)，組織搗碎機(jī)，天平，熒光顯微鏡，顯微鏡，載玻片，蓋玻片，鑷子，接種針，目鏡測(cè)微尺，物鏡測(cè)微尺，恒溫箱，培養(yǎng)皿，濾紙，試管，試管架，移液管，滴管，燒杯，無(wú)熒光載片，蓋玻片，離心管。第二十二頁(yè)，共二十六頁(yè)。【實(shí)驗(yàn)步驟】1選取新鮮的菠菜嫩葉，洗擦干后去除葉梗及粗脈，稱3g于0.35 molL氯化鈉溶液45mL中，置入組織搗碎機(jī)或研缽中。2利用組織搗碎機(jī)低速(5000 rmin)勻漿35 min，或研磨成勻漿。3用6層紗布過(guò)濾，濾液盛于燒杯中。4取濾液4 mL在1000 rmin下離心2 min，棄去沉淀。5將上清液在3000 rmin下離心5 min棄去上清液，沉淀即為葉綠體(混有局部細(xì)胞核)。第二十三頁(yè)，共二十六頁(yè)。6沉淀用0.35 molL氯化鈉溶液懸浮。7取葉綠體懸液l滴置于載玻片上，加蓋玻片后用普通光學(xué)顯微鏡觀察。使用熒光顯微鏡觀察時(shí)，將葉綠體懸液滴在無(wú)熒光的載玻片上，再滴加l滴0.01吖啶橙熒光染料，蓋上無(wú)熒光的蓋玻片后即可觀察。8觀察葉綠體的形態(tài)結(jié)構(gòu)、測(cè)量510個(gè)葉綠體的長(zhǎng)軸和短軸、葉綠體發(fā)射熒光的現(xiàn)象。第二十四頁(yè)，共二十六頁(yè)。【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】繪制普通光學(xué)顯微鏡下觀察的葉綠體形態(tài)示意圖，記錄熒光顯微鏡觀察的現(xiàn)象，分析結(jié)果。第