腸膜明串珠菌基因失活體系的建立

1、腸膜明串珠菌基因失活體系的建立 Advances in Microbiology 微生物前沿, 2014, 3, 57-63 Published Online September 2014 in Hans. /journal/amb /10.12677/amb.2014.33007Construction of Gene Inactivation System for Leuconostoc mesenteroidesXiaoyan Ju, Zhou Zhang, Wenyu Cheng, Hongxing Jin*School of Chemical Engineering and Tech

2、nology, Hebei University of Technology, Tianjin * Email: Received: Aug. 1 , 2014; revised: Aug. 27 , 2014; accepted: Sep. 10 , 2014 Copyright ? 2014 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). /licenses/by/4.0/st th

3、thAbstractTo develop an efficient gene inactivation system for L. mesenteroides, tetracycline-resistant gene cassettes were ligated with pTA2 T vector. Then upsteam and downsteam flanking regions of the ack (acetate kinase) gene were directionally inserted into left and right MCS (multiple cloning s

4、ite) of the T vector, respectively. The resulting homologous recombination suicide vector was transformed into Leuconostoc. The ack gene of chromosome was inactivated and a mutant strain was obtained. To confirm whether ack was inactivated, the ability of mutant strain synthesizing acetic acid was a

5、nalyzed and an ack fragment was amplified by PCR. PCR analysis showed that a fragment of ack gene in the mutant strain was 1200 bp longer than that in the original strain. Compared with the original strain, the yield of acetic acid in the mutant was decreased by 49.1%. The results indicated that ack

6、 gene was successfully knocked out. The gene inactivation system for L. mesenteroides was constructed.KeywordsLeuconostoc, Gene Inactivation, Homologous Recombination, Acetate Kinase腸膜明串珠菌基因失活體系的建立莒曉艷，張 舟，成文玉，金紅星*河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津 * Email: *通訊作者。57腸膜明串珠菌基因失活體系的建立收稿日期：2014年8月1日；修回日期：2014年8月27日；錄用日期：2014年

7、9月10日摘要構(gòu)建腸膜明串珠菌的基因失活體系。四環(huán)素抗性基因表達(dá)盒連接到pTA2 T載體上，在T載體的左右多克 隆位點上分別定向插入ack(乙酸激酶)的上、下游同源臂，構(gòu)建成自殺性同源重組載體，轉(zhuǎn)化明串珠菌， 使染色體的ack失活，得到突變型。檢測突變型產(chǎn)乙酸的量并利用PCR驗證ack失活。與原始菌株相比， 突變型的乙酸產(chǎn)量減少49.1%；突變型的ack PCR擴(kuò)增產(chǎn)物比原始菌株的大1200 bp左右。成功地使ack 基因失活，說明腸膜明串珠菌基因失活體系的構(gòu)建成功。關(guān)鍵詞明串珠菌，基因失活，同源重組，乙酸激酶1. 引言明串珠菌(Leuconostoc)是韓國泡菜、德國泡菜和腌菜等發(fā)酵蔬菜中的

8、優(yōu)勢細(xì)菌，在保持產(chǎn)品的質(zhì)量 中起著重要作用 1 。明串珠菌是耐氧的革蘭氏陽性細(xì)菌 2 ，底物通過戊糖磷酸解酮酶 (Pentose PhosphoKetolase, PPK)途徑而脫氫并產(chǎn)生能量(見圖 1)。 明串珠菌在食品和醫(yī)藥工業(yè)中具有生成雙乙酰、葡聚糖、甘露醇和 2, 3-丁二醇、代謝產(chǎn)生細(xì)菌素等 應(yīng)用3 4。明串珠菌是美國 FDA 認(rèn)可的 GRAS 菌，也是國家衛(wèi)計委認(rèn)可的安全菌5，不產(chǎn)內(nèi)毒素，能 分泌特異性胞外蛋白且沒有蛋白降解活性，因此明串珠菌是表達(dá)異源蛋白的很好的候選菌6。 產(chǎn)業(yè)升級轉(zhuǎn)化過程中甘露醇和 2, 3-丁二醇等化學(xué)品需要微生物發(fā)酵產(chǎn)生，從而有利于綠色和環(huán)保。 還有，明串珠

9、菌的染色體基因組只有 2 Mb 左右7，故發(fā)酵周期短且可作為底盤生物或精簡基因組而構(gòu) 建成優(yōu)勢小基因組微生物。 因此， 明串珠菌具有巨大的應(yīng)用價值， 已成為國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點8-15。Figure 1. The main carbon metabolic pathway of L. mesenteroides 圖 1. 腸膜明串珠菌主要碳代謝途徑58腸膜明串珠菌基因失活體系的建立本文以乙酸激酶基因 ack 為目標(biāo)序列，以四環(huán)素為篩選標(biāo)記，構(gòu)建自殺性重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化腸膜明串 珠菌，使染色體上基因失活，獲得突變型菌株。通過 PCR 擴(kuò)增和產(chǎn)物檢測，驗證基因失活體系的構(gòu)建成功。2. 材料與方法2.1

10、. 材料2.1.1. 菌株與質(zhì)粒 本文所用的菌株和質(zhì)粒，見表 1。 2.1.2. 試劑和儀器 工具酶為 TaKaRa 的；其它試劑為分析純；主要儀器有 DL9700 型基因擴(kuò)增儀、Bio-Rad Gene Pulser XcellTM 電擊儀、722N 型可見分光光度計。 2.1.3. 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 在 37、150 r/min 下用 LB 培養(yǎng)大腸桿菌；在 30、120 r/min 下用 MRS16培養(yǎng)腸膜明串珠菌。2.2. 方法2.2.1. DNA 操作 明串珠菌基因組 DNA 的提取參照文獻(xiàn)16，電轉(zhuǎn)化參照文獻(xiàn)9。 大腸桿菌的質(zhì)粒提取參照文獻(xiàn)17，大腸桿菌的轉(zhuǎn)化采用 CaCl2 法。

11、 引物序列見表 2，PCR 擴(kuò)增過程見表 3。 2.2.2. ack 的 PCR 擴(kuò)增與測序 參照 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293(GenBank accession number CP000414) 的乙酸激酶基因(ack)序列設(shè)計引物對 A1-A2，擴(kuò)增 ack。將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到 pTA2-T 載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿 菌 DH5，送樣測序。Table 1. Bacterial strains and plasmids used in this study 表 1. 實驗所用的菌株和質(zhì)粒Strains or pla

12、smids Bacterial strains E. coli DH5 CGMCC1.10327 Leu ack:Tet Plasmids pBR322 pTA2-T pTA2-ack pTA2-Tet pTA2-T-U pTA2-T-U-D TetR T-Vector, 2.98kb, AmpR, lacZ pTA2 containing ack fragment from L. mesenteroides pTA2 containing Tet fragment from pBR322 pTA2-Tet containing ack upstream fragment from pTA2-

13、ack pTA2-T-U containing ack downstream fragment from pTA2-ackR RPhenotypes and correlative charactersSources80 LacZM15, deoR, recA1, endA1, hsdR17, supE, thi, gyrA, relA L. mesenteroides CGMCC1.10327 with ack knock-outThis lad This lad This workThis lad TOYOBO This work This work This work This work

14、59腸膜明串珠菌基因失活體系的建立 Table 2. Primers used in this study 表 2. 實驗所用的引物Primers T1 T2 A1 A2 U1 U2 D1 D2 Y1 Y2 Sequences(53) TTTGACAGCTTATCATCGA ATTCTTGGAGTGGTGAATC TGCAATCATCACAGTTAAG CTTAATTACTGACGTGCAC TTTCGGTACCCATCACAGTT(KpnI) GCAGTCTCGAGCGTTCAGTTA(XhoI) ATAGTCTGCAGTCATTTAGGT(PstI) CAGCTCTAGACTTCTTCAT

15、TTA(XbaI) GGGTTGTTGTTGATGATG TGTGCGTGAGTATTGGTTTable 3. Steps of PCR 表 3. PCR 步驟Fragment TetR ack upsteam fragment downsteam fragment recombination confirmation 94?C 5 min Denaturation Circulation (30) 94?C 30 s, 47?C 30 s, 72?C 1 min 94?C 30 s, 50?C 30 s, 72?C 1 min 94?C 30 s, 52?C 30 s, 72?C 30 s

16、94?C 30 s, 52?C 30 s, 72?C 30 s 94?C 30 s, 50?C 30 s, 72?C 90 s 72?C 10 min Extension2.2.3. 同源重組載體的構(gòu)建 參照質(zhì)粒 pBR322 序列， 設(shè)計引物對 T1-T2， 擴(kuò)增四環(huán)素抗性基因表達(dá)盒， 將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到 pTA2-T 上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5，提取質(zhì)粒得到中間載體 pTA2-Tet。根據(jù)擴(kuò)增的 ack 序列設(shè)計引物對 U1-U2， 擴(kuò)增 ack 上游片段，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到 pTA2-Tet 的 KpnI 和 XhoI 位點上，轉(zhuǎn)化 DH5，提取質(zhì)粒得到 pTA2-T-U； 設(shè)計引物對 D1-

17、D2， 擴(kuò)增 ack 下游片段， 將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到 pTA2-T-U 的 PstI 和 XbaI 位點上， 轉(zhuǎn)化 DH5，提取質(zhì)粒得到同源重組載體 pTA2-T-U-D。 2.2.4. 腸膜明串珠菌的電轉(zhuǎn)化 同源重組載體 pTA2-T-U-D 轉(zhuǎn)化腸膜明串珠菌， 從平板上挑取單菌落進(jìn)行液體 MRS 培養(yǎng)， 用 5 g/mL 四環(huán)素和 5 g/mL 氨芐檢驗菌株的抗性。 保留具有四環(huán)素抗性且對氨芐敏感的菌株， 作為疑似失活菌株。 2.2.5. 突變型菌株的 PCR 驗證 分別在 ack 基因上游和下游片段序列上設(shè)計引物 Y1、Y2，提取疑似失活菌株的基因組 DNA 作為模 板，通過 PCR 驗證

18、菌株的 ack 基因是否失活。 2.2.6. 發(fā)酵實驗 以 1%接種于 MRS 中，發(fā)酵 24 h 后參照文獻(xiàn)18-21檢測培養(yǎng)基中的乙酸、乳酸、乙醇、雙乙酰和 甘露醇含量。60腸膜明串珠菌基因失活體系的建立3. 結(jié)果與分析3.1. ack 基因克隆和序列同源性約 1.1 kb 的 PCR 擴(kuò)增片段連接到 pTA2-T 載體上， 轉(zhuǎn)化 DH5， 獲得重組子， 重組質(zhì)粒命名為 pTA2-ack。 測序分析表明長度為 1112 bp， 與 L. mesenteroides ATCC8293 的乙酸激酶基因序列比對結(jié)果： 核酸序列同 源性為 99%，有 9 個堿基的差異，氨基酸序列同源性為 100%

19、。已提交到 GenBank，接收號為 JF837336。3.2. 同源重組載體的構(gòu)建以質(zhì)粒 pBR322 為模板， 擴(kuò)增 TetR 基因表達(dá)盒， 獲得的 PCR 產(chǎn)物長約 1.2 kb， 與 pTA2-T 載體連接， 重組質(zhì)粒命名為 pTA2-Tet。 擴(kuò)增的 ack 上游片段為約 500 bp， 與 pTA2-Tet 連接， 重組質(zhì)粒命名為 pTA2-T-U。 擴(kuò)增的 ack 下游片段大小約 450 bp，與 pTA2-T-U 連接，同源重組載體命名為 pTA2-T-U-D。3.3. 疑似失活菌株的篩選將 pTA2-T-U-D 經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化腸膜明串珠菌后，涂布于含四環(huán)素的 MRS 平板上，保留

20、抗四環(huán)素而對氨 芐青霉素敏感的重組子(發(fā)生二次交換的)，廢棄對四環(huán)素和氨芐青霉素都具有抗性的重組子(只發(fā)生一次 交換的)，從而獲得疑似失活菌株。3.4. 疑似失活菌株的 PCR 檢測為了驗證疑似失活菌株染色體上的 ack 基因已被失活，對重組子進(jìn)行了 PCR 檢測。分別以 CGMCC 1.10327(原始菌株)和疑似失活菌株的染色體 DNA 為模板，用相同的引物對 Y1-Y2 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，對得 到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。疑似失活菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物長度比 CGMCC1.10327 的大 1200 bp 左右(圖 2)，與預(yù)期結(jié)果一致。將該疑似失活菌株命名為 Leu ack:TetR。3.5

21、. 種菌株的生理特性比較為了進(jìn)一步驗證 ack 基因的失活并研究 ack 基因失活對腸膜明串珠菌碳代謝的影響，用 MRS 進(jìn)行發(fā) 酵 24 h 時并考察乙酸、乙醇、乳酸、雙乙酰、甘露醇的量。 在相同條件下，CGMCC1.10327 和 Leu ack:TetR 兩種菌株的生物量基本一致。比較兩者的代謝產(chǎn)物M 1 23000 2000 1500 1200 1000 530 1700500M: DNA marker; 1: PCR fragment of ack of CGMCC1.10327; 2: PCR fragment of ack of presumed mutantFigure 2.

22、Characterization of defined ack inactivated mutant by PCR analysis 圖 2. ack 基因失活菌株的 PCR 鑒定61腸膜明串珠菌基因失活體系的建立 Table 4. Comparison of fermentation parameters of the two strains (Unit: g/L) 表 4. 兩菌株的發(fā)酵參數(shù)比較(單位：g/L)Strains CGMCC1.10327 Leu ack:TetRAcetic acid 0.40 0.02 0.21 0.01Diacetyl 1.56 0.06 1.31 0.0

23、4Ethanol 2.02 0.11 2.18 0.12Lactate 9.15 0.31 9.14 0.26Mannitol 3.04 0.11 3.02 0.09表明，突變菌株的乙酸濃度為 0.20 g/L，比原始菌株少 49.1%；突變菌株的雙乙酰濃度為 1.21 g/L，比原 始菌株少 16.3%；突變菌株的乙醇濃度為 2.21 g/L，比原始菌株高 8.3%；產(chǎn)乳酸和甘露醇的差不多(見表 4)。4. 討論自然情況下，菌體內(nèi)自發(fā)的同源重組效率相當(dāng)?shù)汀?008 年韓國的 Eom22以摘要形式報道過檸檬明 串珠菌的基因失活， 此后還沒有明串珠菌的相關(guān)報道。 本研究成功建立了腸膜明串珠菌的基

24、因失活體系。 本研究使腸膜明串珠菌的 ack 基因失活， 從而阻礙了乙酸合成， 導(dǎo)致乙酸的量減少和乙醇的量增加， 符合理論上的預(yù)期結(jié)果。由此可見，乙酸的合成沒有完全阻斷，因為染色體上存在另一個拷貝的乙酸激 酶基因(已克隆該 ack，GenBank 的接收號為 JF809796)。若使另一個拷貝的 ack 也失活，就可以改造成為 高產(chǎn)乙醇的明串珠菌菌株。5. 結(jié)論本研究成功地使染色體的 ack 基因失活，說明腸膜明串珠菌基因失活體系的構(gòu)建成功。項目基金天津市科技計劃項目(“明串珠菌發(fā)酵生產(chǎn)甘露醇研究”，No. 12ZXCXSY06900)；河北省自然科學(xué) 基金項目(“通過基因敲除研究明串珠菌的中

25、心碳代謝調(diào)控”，No. C2011202112)；河北省科技支撐計劃 項目(“以甘蔗/紅糖為原料用明串珠菌發(fā)酵生產(chǎn)甘露醇”，No. 13212405)。參考文獻(xiàn) (References)1 2 成文玉, 金紅星 (2012) 明串珠菌的基因研究進(jìn)展. 中國釀造, 2, 24-28. Eom, H.-J., Cho, S.K., Park, M.S., et al. (2010) Characterization of Leuconostoc citreum plasmid pCB18 and development of broad host range shuttle vector for

26、lactic acid bacteria. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 15, 946-952. Yi, A.-R., Lee, S.-R., Jang, M.-U., et al. (2009) Cloning of dextransucrase gene from Leuconostoc citreum HJ-P4 and its high-level expression in E. coli by low temperature induction. Journal of Microbiology and Biotechnolog

27、y, 8, 829835. 成文玉, 金紅星, 金正煥 (2012) 明串珠菌的碳代謝調(diào)控研究進(jìn)展. 中國釀造, 6, 6-8. 衛(wèi)生部 (2012) 關(guān)于將腸膜明串珠菌腸膜亞種列入可用于食品的菌種名單的公告. 中國食品衛(wèi)生雜志, 4, 305. Hemme, D. and Foucaud-Scheunemann, C. (2004) Leuconostoc, characteristics, use in dairy technology and prospects in functional foods. International Dairy Journal, 6, 467-494. 明

28、串珠菌的基因組. /genome/?term=leuconost oc Eom, H.-J., Moon, J.-S., Cho, S.K., et al. (2012) Construction of theta-type shuttle vector for Leuconostoc and other lactic acid bacteria using pCB42 isolated from kimchi. Plasmid, 67, 35-43. 張舟, 成文玉, 金紅星 (2014) 明串珠菌的穩(wěn)定高效電轉(zhuǎn)化. 中國乳品工業(yè), 1, 18-20.34 5 6 7 8 910 崔虎山, 李冬梅, 李艷茹等 (2013) 抑菌性明串珠菌的篩選及發(fā)酵特性研究. 生物技術(shù), 6, 93-96. 11 李自強(qiáng), 成文玉, 金紅星 (2013) 牛乳中添加不同果汁對明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)雙乙酰的影