植物脫毒快繁技術(shù)

1、關(guān)于植物脫毒快繁技術(shù)第一張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月一、病毒危害 多數(shù)栽培植物，尤其無性繁殖植物，都易受到一種或幾種，甚至幾十種病毒的侵染。例如，草莓染60多種病毒。并且隨著培養(yǎng)時間的推移，侵染病毒的種類越來越多。 植物病毒病原體可通過維管束傳導(dǎo)。因此，對無性繁殖的植物來說，一旦感染上病毒之后，就會代代相傳越趨嚴(yán)重。 受病毒侵染的植物生長緩慢、畸形、產(chǎn)量大幅度下降，品質(zhì)變劣，甚至完全喪失商品價值。第二張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 目前，對細(xì)菌和真菌侵染的病害，可通過藥物處理達(dá)到治愈的目的。但還沒有治病毒的特效藥。種子一般不帶病毒(豆類植物除外)，種子繁殖可得無毒植株

2、。但對于無性繁殖植物，必須采取一些特殊方法脫除病毒。第三張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 脫毒快繁的一般過程 1、診斷：首先了解供試材料感染病毒的種類 2、莖尖培養(yǎng)脫毒或結(jié)合熱處理 3、鑒定 4、繁殖 5、馴化移植第四張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 1、熱處理脫毒原理： 病毒進(jìn)入植物細(xì)胞后，隨植物細(xì)胞DNA一起復(fù)制。熱處理并不能殺死細(xì)胞，只是鈍化病毒的活性，使病毒在植物體內(nèi)增殖減緩或增殖停止，而失去病毒的侵染能力。熱處理是一種物理效應(yīng)，可加速植物細(xì)胞分裂，在激烈分裂的細(xì)胞中正常核蛋白合成占優(yōu)勢，使植物細(xì)胞在與病毒繁殖的競爭中取勝。因此加速分生組織細(xì)胞的分裂，能夠獲得無病毒

3、植株。 二、脫毒方法 (一) 熱處理脫毒 第五張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 依據(jù)病毒對高溫的敏感，寄主耐高溫。利用這一差異，選擇適當(dāng)?shù)臏囟群吞幚頃r間，進(jìn)行高溫處理，就能使寄主體內(nèi)病毒濃度降低，傳遞速度減慢或失去活性，而寄主細(xì)胞仍然存活，并加快分裂和生長。第六張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月(1)溫湯浸漬處理 (2)熱空氣處理 2、熱處理脫毒方法第七張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（1）溫水浸漬處理 適用于休眠器官，在50左右的溫水中浸漬10min至數(shù)小時，方法簡便易行，但易使材料受傷。第八張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）熱空氣處理 熱空氣處理對

4、活躍生長的莖尖效果較好。將生長的盆栽植株移入溫?zé)嶂委熛鋬?nèi)，一般35-40。處理時間因植物而異，短則幾十分鐘，長可達(dá)數(shù)月。第九張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月熱處理廣泛應(yīng)用于葡萄、草莓、馬鈴薯和菊花等植物。如：葡萄置于38 可去除扇葉病毒。熱處理對葡萄扇葉病毒、草莓斑駁病毒、蘋果花葉病毒等球形病毒有作用，而對另一些病毒不起作用，因此，必須與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合脫毒效果更好。第十張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第十一張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 植物的去病毒技術(shù)，實質(zhì)上就是采取不含病毒顆?；虿《绢w粒含量甚少的0.10.5mm帶12個葉原基的莖尖作為外植體，進(jìn)行微繁殖，使

5、其培養(yǎng)成完整的無病毒小植株的技術(shù)。（二）莖尖培養(yǎng)脫毒第十二張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 1、莖尖培養(yǎng)脫毒原理 病毒在植物體內(nèi)分布不均勻，其數(shù)量隨植株部位及年齡而異，越靠近莖頂端區(qū)域，病毒感染的程度越低，生長點即分生組織（約0.1-1mm）幾乎不含或含病毒很少。 第十三張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 1、傳導(dǎo)抑制。植物體病毒的移動主要靠2條途徑：一是通過維管系統(tǒng)，而分生組織中尚未形成維管系統(tǒng)；二是通過胞間連絲，但這條途徑病毒移動速度非常慢，趕不上莖尖和根尖細(xì)胞不斷分裂和活躍的生長速度。 2、酶缺乏。莖尖中缺乏病毒合成所需的酶系，存在高水平內(nèi)源激素，可抑制病毒的增殖。 莖

6、尖分生組織不帶病毒，可能有4方面的原因：第十四張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月3、能量競爭。當(dāng)植物細(xì)胞分裂DNA復(fù)制時，病毒DNA隨著復(fù)制。因此，植物細(xì)胞分裂和病毒繁殖之間存在相互競爭。在旺盛分裂的分生組織中，代謝活動很高，正常核蛋白合成占優(yōu)勢，使病毒無法進(jìn)行復(fù)制。4、抑制因子存在。在植物體內(nèi)存在有一種“病毒鈍化系統(tǒng)”（抑制因子假說），在分生組織中的活性最高，因而使分生組織不受侵染。第十五張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2、培養(yǎng)基 一般以White、MS為基本培養(yǎng)基，提高鉀鹽和銨鹽含量有利于莖尖生長。MS培養(yǎng)某些植物莖尖時，有些離子濃度過高應(yīng)稀釋。在雙子葉植物中，激素可能在

7、第2對葉原基中合成，所以莖尖的圓錐組織生長激素不能自給，必須加入生長素與細(xì)胞分裂素，濃度要合適。在生長素中應(yīng)避免用易促進(jìn)愈傷組織化的2，4-D，宜用NAA或IBA；細(xì)胞分裂素用KT或BA；GA3對某些植物莖尖培養(yǎng)有用。第十六張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月材料選擇、消毒 微莖尖的剝?nèi)?接種3、莖尖的培養(yǎng)方法第十七張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月3、莖尖的培養(yǎng)方法 需要一臺解剖鏡（8-40倍）。 剝離莖尖要迅速并盡快接種，或在一個襯有無菌濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行操作，以防莖尖變干。 莖尖分生組織由于有彼此重疊的葉原基的嚴(yán)密保護(hù)，只要仔細(xì)解剖，(無須表面消毒)就可得到無菌的外植體。

8、有時消毒處理會增加培養(yǎng)物的污染率。即：葉片包被嚴(yán)緊的芽，如菊花、蘭花，只須75%酒精中浸蘸一下，而葉片包被松散的芽，如香石竹、馬鈴薯等，則要用0.1%次氯酸鈉表面消毒10min。第十八張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月莖尖長（）葉原基數(shù)小植株數(shù)脫毒植株數(shù)脫毒率（）0.1215024480.272421842.90.646400離體莖尖大小對馬鈴薯脫毒效果的影響 切取莖尖越小脫毒效果越好，但太小不易成活，過大又不能保證完全除去病毒，所以莖尖大小要合適。第十九張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 剝?nèi)∏o尖過程: 解剖鏡下用解剖針將葉片剝

9、掉，解剖針要常消毒。當(dāng)一個半圓球的頂端分生組織充分暴露出來之后，用解剖刀片將帶1-2個葉原基的分生組織切下，接到培養(yǎng)基上。 將接種的莖尖置于22左右溫度下。 2000-3000lx 16h/d 光照下培養(yǎng)。由于在低溫和短日照下，莖尖有可能進(jìn)入休眠；所以較高的溫度和充足的日照時間必須保證。微莖尖需數(shù)月才能成功。第二十一張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 莖尖培養(yǎng)的繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)和一般器官的培養(yǎng)相同。 莖尖培養(yǎng)脫毒，由于其脫毒效果好，后代穩(wěn)定，所以是目前培育無病毒苗最廣泛和最重要的一個途徑。第二十二張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月4、影響微莖尖成活及脫毒的因素 （1）母體材料

10、病毒侵染程度被單一病毒感染的植株脫毒較容易，復(fù)合感染的較難。 （2）外植體大小 在最適培養(yǎng)條件下，外植體的大小決定莖尖的存活率，外植體越大，產(chǎn)生再生植株的機(jī)會也就越多。除了外植體的大小之外，葉原基的存在與否也影響分生組織形成植株的能力，一般認(rèn)為，葉原基能向分生組織提供生長和分化所必需的生長素和細(xì)胞分裂素。第二十三張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）培養(yǎng)條件 在莖尖培養(yǎng)中，光下培養(yǎng)的效果通常比暗培養(yǎng)效果好，如馬鈴薯莖尖培養(yǎng)時，當(dāng)莖已長到1cm高時，光照強(qiáng)度便增加到4000lx。 （3）外植體的生理狀態(tài) 莖尖最好要由活躍生長的芽上切取。 取芽的時間也很重要，一般選萌動期較好。否則采用適

11、當(dāng)?shù)奶幚恚蚱菩菝卟拍苓M(jìn)行。 第二十四張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）莖尖與熱處理相結(jié)合方法 能克服單獨莖尖培養(yǎng)時，莖尖過小成活率太低，莖尖太大又脫除不掉病毒的缺點。 1、熱處理后取較大莖尖培養(yǎng)獲得脫毒苗。 2、取莖尖（或莖段）培養(yǎng)獲得無菌苗。然后將試管苗熱處理，再取莖尖培養(yǎng)獲得脫毒苗。 第二十五張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（四）其它途徑脫毒 1、愈傷組織培養(yǎng)脫毒 2、莖尖微體嫁接 3、化學(xué)療法脫毒 第二十六張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月1、愈傷組織培養(yǎng)脫毒 愈傷組織細(xì)胞帶病原菌不均一，部分細(xì)胞不帶病毒，由這些細(xì)胞再生的植株是無病毒的。多次繼代的愈傷組

12、織中病毒含量下降，甚至檢測不出病毒。第二十七張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 愈傷組織的某些細(xì)胞不帶病毒原因： 1、病毒的復(fù)制速度趕不上細(xì)胞的增殖速度； 2、有些細(xì)胞通過突變獲得了抗病毒的抗性。 愈傷組織脫毒的缺陷是植株遺傳性不穩(wěn)定，可能會產(chǎn)生變異植株。第二十八張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2、莖尖微體嫁接 木本植物莖尖培養(yǎng)難以生根成植株，將實生苗砧木在人工培養(yǎng)基上種植培育，再從成年無病樹枝上切取0.4-1mm莖尖，在砧木上進(jìn)行試管微體嫁接，以獲得無病毒幼苗。第二十九張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月3、化學(xué)療法脫毒 病毒抑制劑第三十張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2

13、022年6月 三、脫毒快繁材料的選擇 應(yīng)注意以下幾點： 1）品種要可靠 2）要選擇經(jīng)當(dāng)?shù)卦耘啻_認(rèn)的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種來作 為脫毒材料 3）名貴的植物良種 4）植物生長旺盛期，再生率高，脫毒效果好 第三十一張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 四、植物病毒的鑒定 1、外觀判斷法 2、指示植物法 3、抗血清鑒定法 4、電子顯微鏡檢查法 5、酶聯(lián)免疫鑒定法(ELISA) 第三十二張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 1、外觀判斷法： 帶病毒株往往葉片發(fā)黃，凹凸不平，畸形，可根據(jù)這些表現(xiàn)來判斷。但有些病毒表現(xiàn)不明顯，僅靠這一方法還不夠。第三十三張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 2、指

14、示植物檢測法： 指示植物又稱鑒別寄主，指的是對某種或某些特定病毒非常敏感，而且癥狀表現(xiàn)十分明顯的植物。 通常不同病毒應(yīng)選用不同的植物。馬鈴薯病毒常用指示植物有千日紅、曼陀羅、豇豆、辣椒等。 分為2種 汁液感染法（摩擦接種法） 嫁接檢測法第三十四張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 3、抗血清鑒定法（抗原抗體反應(yīng)） 原理：由于病毒是由蛋白質(zhì)和核酸組成的，是一種較好的抗原。將病毒給動物注射后產(chǎn)生抗體?？乖涂贵w結(jié)合產(chǎn)生血清反應(yīng)?？乖翰《尽？贵w：是指生物體在外來抗原的刺激下產(chǎn)生的一種免疫球蛋白，主要存在于血清中，含抗體的血清稱為抗血清。 4、電子顯微鏡檢查法 直接觀察有無病毒存在，并根據(jù)病毒

15、的大小、形狀和結(jié)構(gòu)等來判斷病毒種類。第三十五張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 5、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA) enzyme linked immunosorbent assay 把抗原-抗體的免疫反應(yīng)于酶的催化反應(yīng)相結(jié)合而發(fā)展起來的一種綜合性技術(shù)，靈敏度高，特異性強(qiáng)，發(fā)展最快應(yīng)用最廣的方法。 原理：采用酶標(biāo)記的特異抗體指示抗原-抗體的結(jié)合，從而檢測樣品中的抗原定量測定法。第三十六張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：(1)將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。(2)加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接

16、觸反應(yīng)一段時間，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。(3)加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。(4)加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。第三十七張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月第三十八張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 五、快速繁殖 莖尖培養(yǎng)得到的脫毒苗不多，用于生產(chǎn)需擴(kuò)大繁殖。 擴(kuò)繁方法： 1）組培快繁 2）無毒苗栽到土壤中進(jìn)行擴(kuò)繁。如甘薯、草 莓等利用蔓，馬鈴薯、姜、蒜等利用地下

17、部分繁殖。為了預(yù)防病毒再感染，擴(kuò)繁應(yīng)在培育溫室或防蟲罩內(nèi)，因為昆蟲傳播病毒。 3）兩種方法相結(jié)合，試管內(nèi)擴(kuò)繁，移栽后再擴(kuò)繁。 第三十九張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月注意： 1、培養(yǎng)變異的產(chǎn)生，應(yīng)及時去除 2、脫毒苗并非永遠(yuǎn)是無毒苗，由于昆蟲等的傳播，不免會再感染病毒，所以要經(jīng)常脫毒，一般脫毒苗用13代 。 脫毒試管苗為原原種繁殖一代為原種原1代原2代第四十張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月楓樹快繁圖示第四十一張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月楓樹快繁圖示第四十二張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月月季快繁圖示第四十三張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月月

18、季快繁圖示第四十四張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月月季快繁圖示第四十五張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月月季快繁圖示第四十六張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月腋芽在生根培養(yǎng)基中生長兩周，即可有小的幼根生成，三周后，幼根可長至2 cm長。 將上述月季苗經(jīng)過煉苗后，從培養(yǎng)基中取出，小心地洗去根上的培養(yǎng)基，然后將其接種在培養(yǎng)介質(zhì)中(營養(yǎng)土:蛭石:珍珠巖= 3:1:1)，再將培養(yǎng)介質(zhì)澆透水，用保鮮膜封上，以防止水分的散失，然后將其放在弱光、濕度大的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，待長出新根后，可移入田間土壤中。具體過程如下圖：月季快繁圖示第四十七張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月植物快

19、繁的一般程序1.無菌母體植株的制備： （取材、植物激素、 防止褐化和有害物積累）2.不定芽增殖 ： （增殖的途徑：誘導(dǎo)形成大量胚狀體；誘導(dǎo)形成大量不定芽；促進(jìn)腋芽的快速形成；愈傷組織增殖）3. 完整植株的形成： 4. 再生植株的馴化 ： 5. 再生植株的鑒定： （植物形態(tài)學(xué)鑒定；細(xì)胞學(xué)鑒定）第四十八張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）離體繁殖的一般技術(shù)1.外植體的選擇(1)根據(jù)培養(yǎng)目的選擇(2)考慮種質(zhì)、取材大小、時期和材料的生理狀態(tài)，具有代表性第四十九張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月2培養(yǎng)物的增殖 植物的種類和自然生長習(xí)性不同，其增殖方式及所采取的相應(yīng)技術(shù)措施也不一樣。一般來講，培養(yǎng)物的增殖有以下4種方式 第五十張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月芽增殖特點主要表現(xiàn)在培養(yǎng)方法簡單，能高度保持遺傳穩(wěn)定性，能長期繼代繁殖。目前采用這一方式快速繁殖的植物有石竹、馬鈴薯、甘薯、草莓、葡萄和月季等。 第五十一張，PPT共五十九頁，創(chuàng)作于2022年6月 不定芽增殖 從現(xiàn)存