核醫(yī)學(xué)分子核醫(yī)學(xué)

1、分子核醫(yī)學(xué)進(jìn)展 1 定義：分子生物學(xué)與實驗核醫(yī)學(xué)結(jié)合。內(nèi)涵：利用示蹤技術(shù)觀察體內(nèi)的生化過程并與相關(guān)基因聯(lián)系起來的一門分支學(xué)科，分子識別是其重要理論基礎(chǔ)。研究領(lǐng)域：受體顯像 基因顯像 重組單抗片段、肽類放射性藥物及微型抗體。 2特點： 1）深入分子水平認(rèn)識疾病，通過細(xì)胞信息傳導(dǎo)、基因表達(dá)、生化代謝等多個方面，在解剖學(xué)和功能癥狀出現(xiàn)之前發(fā)現(xiàn)病變信息。2）通過特定示蹤劑，將疾病與基因表達(dá)的改變聯(lián)系起來，提高疾病診治的層次。 3）當(dāng)代分子生物學(xué)研究成果是其理論源泉。4）分子識別是分子核醫(yī)學(xué)的理論基石。 5）生化代謝的評價是其理論重要組成部分。3二、當(dāng)前的幾個熱門研究領(lǐng)域（六個領(lǐng)域）1、受體顯像：舉例

2、a、b、c2、受體介導(dǎo)的放射配體治療3、放免顯像（RI I）4、放免治療（RIT）5、基因顯像和基因放射治療 原理：將放素標(biāo)記的反義寡核苷酸注入受試者體內(nèi)，由于體內(nèi)癌基因等有過度表達(dá)，通過體內(nèi)核酸分子雜交而與相應(yīng)靶基因結(jié)合，以定位、定量顯示特異靶基因，從而進(jìn)行基因診斷以及破壞相應(yīng)致病基因而達(dá)到治療的目的。4反義寡核苷酸基因顯像劑的特點：1）分子量小4）無免疫原性2）穿透力強5）與靶結(jié)合快3）特異性高 6）靶/非靶比值高反義寡核酸的基本要求：P303基因顯像必備條件：1）胞漿中必須有足夠的mRNA基因產(chǎn)物標(biāo)記反義探針必須與靶細(xì)胞特異選擇性結(jié)合并保持穩(wěn)定。 56、代謝顯像：主要指PET顯像原理：+

3、衰變的放素與體內(nèi)靶物質(zhì)作用而損失能量被吸收、轉(zhuǎn)化為二個方向相反的高能r光子。它提供了很好的空間定位信息，經(jīng)計算機處理重新購成清晰的三維圖像。 6+核素特點：大部分為人體基本元素，全部為人工生產(chǎn)湮滅輻射可獲得三維圖像T1/2短，一次可給較大劑量，圖像清晰重復(fù)給藥，動態(tài)觀察。臨床應(yīng)用舉例： 18F-萄糖研究腦功能狀況，老年癡呆時攝取18F-萄，測腦部放射性下降。 腦瘤區(qū)18F-萄。 7三、分子生物學(xué)中的示蹤技術(shù)及應(yīng)用P271（一）核酸標(biāo)記：標(biāo)記上放射性核素的又叫探針，或叫基因探針。1、探針分類：基因組DNA探針 CDNA探針 以mRNA為模板CRNA探針 反向合成的DNA片段 人工合成寡核探針的標(biāo)

4、記物分類 放素：32P 33P 35S 3H 14C 125I等非放：生物素、地高辛等。8兩類探針的比較： 放素探針非放探針靈敏度高、應(yīng)用廣對人體有害、壽命短靈敏度低，對核酸分子有修飾作用，但無放射危害，壽命長六種常用的放素的性質(zhì)、特點 P273 表111 92、核酸探針的具體標(biāo)記方法： 體內(nèi)標(biāo)記：將32P磷酸鹽加到細(xì)胞或細(xì)菌培養(yǎng)體系中，使32P參入新合成的核酸分子上。 酶促法體外標(biāo)記：很常用，先將核素預(yù)先標(biāo)記在核苷酸上，然后利用多種核酸聚合酶將核苷酸參入到探針分子中或交換到探針分子中去。 常見的幾種外標(biāo)記方法：1）DNA缺口平移法：已有試劑盒提供如Amash ema, promega, BR

5、2等公司。2）隨機引物法：也有試劑盒上市。10 兩種方法注意點：模板越小，產(chǎn)物的比活度越高；產(chǎn)物的長度與加入寡核苷酸引物的量成正比；有5種原因常引起標(biāo)記礙障： a、DNA雙鏈未充分變性； b、DNA純度不佳； c、Klenow酶效價不夠； d、DNA片段太少，G50分離時丟失； e、DNA用量過大或過少。 11 3）單鏈DNA探針標(biāo)記：在M13噬菌體的環(huán)狀單鏈上合成互補DNA鏈時參入放素。 4）CDNA探針標(biāo)記：以mRNA為模板，在引物和四種脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP，其中一種為標(biāo)記物）存在下，經(jīng)酶促聚合反應(yīng)合成互補標(biāo)記CDNA。 5）RNA探針標(biāo)記：P275 6）DNA探針的5端標(biāo)記：P2

6、75 7）DNA探針的3端標(biāo)記：P276 8）PCR-DNA標(biāo)記：PCR擴增時通過合成DNA將32P-dNTP參入到DNA分子中達(dá)到標(biāo)記作用。 將32PdNTP參入到DNA分子中達(dá)到標(biāo)記作用。123、核酸標(biāo)記的檢測核酸標(biāo)記方法很多，雖已大部分商品化和標(biāo)準(zhǔn)化，但環(huán)節(jié)繁雜，試劑質(zhì)量及操作等影響因素多，標(biāo)記完成后應(yīng)定性、定量檢測。 參入核酸中的cpm主要兩個指標(biāo)：參入比= -100% 加入的標(biāo)記品總cpm 比活性：指每微克核酸中的放射性計數(shù)cpm/gDNA(RNA) 13 4、核酸標(biāo)記注意事項：1）同位素的安全防護(hù)2）核酸原料一般用50-150ng，越少，產(chǎn)品比活度越高。3）標(biāo)記前體32P-dNTP

7、，用時須真空抽干4）使用的Ependoff管和吸頭需先硅化、防止吸附。5）標(biāo)記物應(yīng)及時用，-20可保存13天6）嚴(yán)格按廠家說明書操作，最好做預(yù)實驗。7）個別標(biāo)記方法標(biāo)記前需做DNA變性處理。14（二）核酸分子雜交技術(shù) 定義：具有一定同源性的核酸單鏈在一定條件下按鹼基互補原則形成異源雙鏈的過程。 雜交步驟：核酸探針與核酸樣品（處理好的）混合反應(yīng)漂洗ARG or測量分析。固相雜交：1）Southern印跡雜交：P277、查DNA序列，分析基因結(jié)構(gòu)、并進(jìn)行定性、定量研究。 步驟：提取DNA酶解DNA瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)移硝酸纖維膜上并固定雜交ARG 2）Nothern印跡雜交法：主要查RNA序列，步驟大致同

8、上。15 3）斑點雜交：將變性的DNAorRN點樣在硝酸纖維膜上，然后雜交，ARG。 4）反向斑點雜交：將多種未標(biāo)記的已知序列寡核苷酸探針點樣于纖維膜，再將待分析的DNA用放素標(biāo)記后與其雜交，ARG根據(jù)雜交點判斷DNA序列。P278 5）菌落、噬菌斑原位雜交：將微生物點于纖維素膜或貼印方式轉(zhuǎn)移微生物，曝露細(xì)胞DNA，鹼化DNA變性，并固定，再進(jìn)行斑點雜交過程。 6）組織、細(xì)胞原位雜交：將組織切片或細(xì)胞固定在玻片上，用已知的標(biāo)記核酸探針進(jìn)行雜交。 特點；不需以細(xì)胞中提取DNAorRNA，通過ARG在顯微鏡下觀察銀顆粒，進(jìn)行定位、定性研究，定位準(zhǔn)。敏感性高，對含量極低的靶序列也可檢測。 16注：如

9、原位雜交采用非放探針，可染色顯微觀察。液相雜交： 將變性的單鏈核酸與探針在溶液中自由雜交，適當(dāng)方法分離獲得雜交分子、測放了解其特定序列的信息。特點： 1）受檢的目標(biāo)核酸與示蹤的標(biāo)記核酸均不在支持相上。 2）主要用于基因篩選和將基因組中重復(fù)的序列與單一序列分離出來。17（三）DNA序列分析 DNA序列分析的兩個基本步驟 DNA片段的制備的擴增 測定 DNA序列 PCR測序分析：利用一對高特異性引物，可以直接從基因文庫中原始克隆或從極復(fù)雜的基因組DNA中，通過不對稱PCR反應(yīng)制備特定基因片段為測序模板（單鏈DNA），然后用雙脫氧法完成序列分析。 雙脫氧法 指當(dāng)有雙脫氧核糖核苷三磷酸ddNTP參入時

10、，鏈的延長就終止，可以得到一系列長度不同的核酸片段，由于4種原料dNTP中有一種是標(biāo)記的，所以可通過ARG，從圖上讀出被測DNA的鹼基排列序列。常用方法：未端終止法 化學(xué)法 P28018（四）重組DNA和基因工程 重組DNA基因克?。ɑ蚬こ蹋褐覆捎梅肿由飳W(xué)技術(shù)在試管內(nèi)有目的地切割分離純化或人工合成的DNA分子和相應(yīng)的載體，并將其拼接成重組DNA后導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中，使之大量擴增形成克隆，并表達(dá)基因產(chǎn)物。 基因工程的基本步驟：P282了解 與核醫(yī)學(xué)相關(guān)技術(shù)基因診斷：核酸分子雜交技術(shù)中用的放素，主要包括遺傳性疾病、癌基因與抗癌基因的研究。 （五）聚合酶鏈反應(yīng)PCR P284 了解 （六）蛋

11、白質(zhì)合成中的核技術(shù)應(yīng)用 P287了解19（七）半抗原標(biāo)記及其應(yīng)用：P215半抗原：定義不能誘導(dǎo)產(chǎn)抗體，但能反應(yīng)。應(yīng)用原理：將半抗原看作為放素去標(biāo)記核酸或抗體，激素等分子（方法已趨成熟）。然后把能與半抗原結(jié)合的相應(yīng)抗體用熒光素、酶或膠體金標(biāo)記上，然后作示蹤研究，通過測熒光素或顯色反應(yīng)進(jìn)行定位和定性研究。20舉例： （1）地高率半抗原標(biāo)記：將地高率通過一個“聯(lián)結(jié)臂”結(jié)在duTP上，再用隨機引物法或其它酶反應(yīng)方法將DIGduTP摻入到核酸上，反應(yīng)完后用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗DIG抗體去結(jié)合，而該酶可顯色反應(yīng)。*）而膠體金即為氯化金分子呈膠體態(tài)粉紅色，具有高電子密度和能與大分子物質(zhì)結(jié)合的特征，可在電鏡，光鏡下進(jìn)行定性，定位研究。2）二硝基苯或三硝基苯（DNP或TNP）半抗原標(biāo)記：它可標(biāo)蛋白、激素、抗體等。示蹤過程酶顯色。21（八）免疫PCR技術(shù)：P216定義：PCR+Ag-Ab結(jié)合反應(yīng)的新技術(shù)。原理：DNA作為標(biāo)記物（看做放素），最后可用PCR將DNA擴增，通過測定DNA的量進(jìn)行定性研究的一種方法?；痉磻?yīng)：1）將待測抗原固化試管底部2）加入生物素標(biāo)記的特異抗體Ab-b3）加入親和