納米材料在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中的應(yīng)用研究進展

1、納米材料在聚合酶鏈?zhǔn)椒错戵w系中的應(yīng)用研究進展摘要】聚合酶鏈?zhǔn)椒错憄r技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)核心技術(shù)之一，研究進步pr擴增效率的方法具有重要意義。傳統(tǒng)進步pr擴增效率的方法具有較多局限性，使得pr擴增仍不能到達理想的效果。隨著納米技術(shù)的開展，納米材料具有特殊的外表效應(yīng)和尺寸效應(yīng)，外表能進展多種修飾，易與生物大分子蛋白質(zhì)、核酸等互相作用，對生物分子的構(gòu)造和功能產(chǎn)生特別的影響。研究利用納米材料來進步pr擴增效率的技術(shù)和方法，具有非常重要的理論意義和應(yīng)用價值。本文引用文獻41篇，綜述了近年來納米材料在pr體系中應(yīng)用的現(xiàn)狀，并展望了今后納米材料在pr體系中應(yīng)用的開展方向及其前景?！娟P(guān)鍵詞】聚合酶鏈?zhǔn)椒错懀?/p>

2、納米材料；特異性；擴增效率；評述appliatinprgressesfnanaterialsnplyerasehainreatinlina，qiaguang-ing，zhulin-hai，tb*(llegefheistry，heialengineeringandaterialssiene，keylabratryfleularandnanprbes，inistryfeduatin，engineeringresearhenterfpestiideandediineinterediateleanprdutin，inistryfeduatin，shandngnraluniversity，jinan25

3、0014)hisrevie，reentappliatinstatusfnanaterialsnprassuarizedith41referenes.partiularly，thedevelpingtrendsandprspetsinthefutureerealsdisussed.keyrdsplyerasehainreatin；

4、anaterials；peifiity；pliatineffiieny；evie1引言1983年ullis創(chuàng)造了聚合酶鏈?zhǔn)椒错?pr)1，并因此榮獲1993年諾貝爾化學(xué)獎。pr可使目的dna分子的合成量呈指數(shù)增長，因此微量的遺傳物質(zhì)在數(shù)小時內(nèi)即能擴增數(shù)百萬倍2，3到達檢測程度，進而可進展測序4、dna探測5，6、基因分析79、食品檢驗10，11、環(huán)境監(jiān)測12，13等。pr技術(shù)具有特異、敏感、快速、易自動化等突出優(yōu)點，徹底改革了分子遺傳學(xué)，成為現(xiàn)代生物學(xué)和藥物科學(xué)最流行的技術(shù)之一，與克壟dna序列分析方法構(gòu)成了整個現(xiàn)代分子生物學(xué)研究工作的基矗盡管pr已開展成為一項相當(dāng)成熟的技術(shù)，但在實際操作中，

5、pr擴增始終存在一些難以克制的問題，如假陰性、假陽性、非特異性擴增以及片狀拖帶或涂抹帶等，尋找解決pr中這些問題的方法至關(guān)重要，通常的方法有向pr體系中添加各種增效劑14，15，優(yōu)化pr體系的各種參數(shù)16，17，改良pr的擴增策略18，19等，這些方法雖然在一定程度上進步了pr的特異性、產(chǎn)量以及效率，但是并未徹底解決上述難題，pr擴增仍達不到理想的預(yù)期效果。近年來，人們試圖從新興學(xué)科與技術(shù)中尋找優(yōu)化pr的方法。納米生物技術(shù)由于其獨特的優(yōu)勢性越來越受到人們的關(guān)注20。尺寸小于100n與生物分子的尺寸相當(dāng)?shù)募{米材料在生物醫(yī)學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用21，22，人們已將多種納米材料引入傳統(tǒng)的pr技術(shù)中。2

6、納米材料對pr體系的影響2.1金納米粒子對pr體系的影響li等23將10n的金納米粒子作為一種新型的優(yōu)化劑添加到pr體系中，考察了金納米粒子對pr特異性的影響。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)金納米粒子的濃度介于0.40.8nl/l之間時，隨著金納米粒子濃度的不斷增高，pr的特異性越來越好；但當(dāng)金納米粒子濃度大于1.0nl/l時，pr的特異性又被抑制。而且，參加金納米粒子在保持pr產(chǎn)量和特異性的前提下，可以拓寬pr體系的退火溫度范圍，退火溫度即使低至25，pr仍具有較好的特異性。li等23認為金納米粒子模擬了體內(nèi)dna復(fù)制過程中單鏈結(jié)合蛋白ssb的作用，選擇性地結(jié)合了單鏈dna，而不是雙鏈dna，從而顯著降低

7、了dna復(fù)制過程中引物和模板的錯配。此前，perales等24通過模擬生物體內(nèi)的擴增策略，成功地將耐熱的ssb蛋白引入到pr體系中，進步了pr的特異性。vu等25深化討論了金納米粒子對pr體系特異性的影響。發(fā)現(xiàn)金納米粒子的作用不是增加pr的特異性，而是更有利于小片段產(chǎn)物的產(chǎn)生，抑制大片段產(chǎn)物的產(chǎn)生，不管該小片段產(chǎn)物是特異性產(chǎn)物還是非特異性產(chǎn)物。而且，隨著金納米粒子濃度的增加，這種作用越來越明顯。他們認為金納米粒子能促進小片段的擴增，是因為納米金與聚合酶發(fā)生了非特異性結(jié)合，是外表化學(xué)作用起到重要作用。li等26研究了13n的金納米粒子對pr體系效率的影響。實驗說明，金納米粒子能使pr體系的產(chǎn)量進

8、步104106倍，反響時間越短，金納米粒子對pr體系產(chǎn)量的進步就越明顯。而且，一樣量的金納米粒子對不同升降溫速度的pr體系的影響不同。與不加金納米粒子的pr體系相比，金納米粒子對升/降溫速度為20/s的實時pr產(chǎn)量的進步可高達104倍，而對升/降溫速度為2/s的普通pr體系，金納米粒子對其產(chǎn)量的進步只有510倍，pr體系的熱循環(huán)越快，金納米粒子對pr產(chǎn)量的進步就越大。li等26認為，金具有良好的熱傳導(dǎo)性，改善了快速升降溫pr體系的熱傳導(dǎo)性，有利于模板與引物更高效的配對，從而進步了pr的產(chǎn)量，優(yōu)化了pr體系。對于金納米粒子與pr各參數(shù)的互相作用，文獻27，28報道了引物共價鍵合到金納米粒子外表的

9、pr。結(jié)果說明，一條引物上游引物或者下游引物或者兩條引物連接到金納米粒子上，在一定范圍內(nèi)，退火溫度對pr體系幾乎沒有影響，pr特異性均較好。米麗娟等29研究pr體系中納米金與dna聚合酶的互相作用機制時發(fā)現(xiàn)，過量的納米金之所以會抑制pr擴增，是因為納米金與聚合酶發(fā)生了互相作用。假設(shè)進步聚合酶用量，可有效消除金納米粒子的這種抑制作用。在pr體系中，納米金通過與游離的dna聚合酶的可逆結(jié)合，動態(tài)調(diào)節(jié)聚合酶的濃度，進而影響pr的擴增結(jié)果。但該機理僅從納米金與聚合酶的互相作用出發(fā)，考慮到pr體系的復(fù)雜性，納米金還有可能與模板、引物等發(fā)生了復(fù)雜的互相作用，更為確切的調(diào)控機制有待深化研究。納米金還可以優(yōu)化

10、pr的擴增策略。pan等30研究基于納米金的多輪擴增發(fā)現(xiàn)，由于納米金可以抑制pr的非特異擴增，可以將pr的有效擴增極限推到第7輪，即使在第6輪擴增中也能得到單一亮堂的目的條帶。而在常規(guī)pr多輪擴增中，無論對dna模板如何稀釋，有效擴增只能進展到第3輪，且隨著擴增輪數(shù)的增加，目的產(chǎn)物的量也呈下降趨勢。納米金輔助的pr再擴增和多輪擴增在一定程度上可取代巢式pr，防止了巢式pr需要設(shè)計兩對引物的繁瑣。實驗還發(fā)現(xiàn)，外表修飾了bps、莖環(huán)dna、以及tritn-100的金納米粒子，雖然外表性質(zhì)發(fā)生了改變，但是仍然能進步pr的特異性和產(chǎn)量。2.2銀納米粒子對pr體系的影響王群等31討論了銀納米粒子對pr體

11、系長片段dna反復(fù)擴增的特異性的影響。實驗結(jié)果說明，對長度為36kb的較長片段基因，銀納米粒子在一定程度上保持了其pr反復(fù)擴增的特異性；而對10kb以上更長片段的反復(fù)擴增，銀納米粒子對其特異性的影響比擬校他們認為，可能是銀納米粒子性改善了常規(guī)pr體系溶液的導(dǎo)熱性能，縮短了整個體系到達溫度平衡所用的時間，從而抑制了非特異擴增；也可能是銀納米粒子與不同狀態(tài)dna分子發(fā)生了選擇性結(jié)合，從而進步了擴增的特異性。2.3磁性納米粒子對pr體系的影響shen等27，32研究了將引物共價鍵合到si2包覆的-fe23磁性納米粒子外表的pr。實驗結(jié)果說明，引物連接到-fe23磁性納米粒子外表，在適宜的條件下，pr

12、反響能順利進展。當(dāng)一條引物上游引物或下游引物連接在-fe23磁性納米粒子外表，而另一條引物下游引物或上游引物未連接時，pr幾乎不受退火溫度的影響；但當(dāng)兩條引物都連接在-fe23磁性納米粒子外表時，pr受退火溫度的影響較大。在一定溫度范圍內(nèi)，退火溫度越高，pr產(chǎn)物特異性越好。而且，將引物與磁性納米粒子連接，產(chǎn)生了新的基于磁性納米粒子的不對稱pr和對稱pr。一條引物連接到磁性納米粒子外表的不對稱pr擴增可以產(chǎn)生大量磁性納米粒子-單鏈dna復(fù)合物，由于單鏈dna產(chǎn)物連接在磁性納米粒子的外表，所以利用外磁場作用可以很容易地將其別離；而兩條引物均連接到磁性納米粒子外表的對稱pr擴增，產(chǎn)生了一種消費納米構(gòu)

13、造聚合物的新方法。2.4納米碳對pr體系的影響2.4.1納米碳管對pr體系的影響ui等33發(fā)現(xiàn)單壁碳納米管snts能對pr產(chǎn)生積極的影響。當(dāng)snts濃度小于3g/l時，能增加pr擴增的產(chǎn)量；而當(dāng)snts濃度大于3g/l時，又會抑制pr反響。此外，snts還可以在一定程度上模擬pr緩沖液中g(shù)2+的重要作用。當(dāng)pr反響液中沒有g(shù)2+時，參加snts能得到與g2+存在時相似的效果，pr的產(chǎn)量沒有太大的差異，都是在snts濃度為3g/l時得到最大產(chǎn)量。為了探務(wù)實驗的機理，他們將snts分別與dna、taq酶進展了孵育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些反響成分聚集在snts周圍，能更好的接觸而發(fā)生反響，因此能進步pr的效率

14、，增加pr反響的產(chǎn)量。當(dāng)snts濃度過高時，因其對pr反響成分的過多連接而破壞了dna，tag酶以及引物的反響條件，從而抑制了pr反響。而且通過x-射線電子光譜圖分析發(fā)現(xiàn)，在pr反響后，snts的結(jié)合能增加，說明其與dna模板、taq聚合酶發(fā)生了強烈的反響，snts與pr各反響成分發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移，充當(dāng)了電子受體和聚合酶的穩(wěn)定劑。2.4.2納米碳粉對pr體系的影響zhang等34發(fā)現(xiàn)納米碳粉np的水懸浮溶液能進步重復(fù)pr和長片段pr擴增的特異性。在沒有np的情況下，重復(fù)pr在第4輪擴增就開場出現(xiàn)非特異性條帶。第5和第6輪擴增出現(xiàn)了明顯的拖尾，幾乎沒有目的條帶。而參加適量的np懸浮液后，pr即使到

15、了第6輪擴增也能得到單一的目的條帶。同時，在長片段pr擴增中參加np懸浮液可以使拖尾現(xiàn)象顯著減少，非特異條帶逐漸消失。但是，np的濃度必須在一定范圍內(nèi)才會有效，濃度太低不能有效進步pr的特異性，濃度過高又會抑制pr反響。原子力顯微鏡結(jié)果說明np與雙鏈dna之間存在潛在的結(jié)合力，因此反響的機理可能是這種結(jié)合力減少了引物與dna模板之間的錯配以及引物二聚體的產(chǎn)生，因此可以進步pr的特異性。但過高濃度的np會產(chǎn)生過高的結(jié)合力，又會阻礙pr的反響。但是np對pr有這樣的影響，還有可能是np與dna聚合酶發(fā)生了互相作用，反響機理尚需進一步討論。2.4.3富勒烯60對pr反響的抑制作用張捷等35研究了富勒

16、烯(60)對pr的影響。隨著60濃度的增加，pr擴增被顯著抑制。60一方面會抑制dna聚合酶的活性，且濃度越高，抑制作用越大，另一方面又會損傷dna單鏈模板，降低dna單鏈模板起始濃度，從而造成pr產(chǎn)物量的降低。他們認為，這是60與dna聚合酶的酶活性位點發(fā)生了互相作用，導(dǎo)致dna聚合酶活性降低，同時60還會結(jié)合到dna單鏈模板上，干擾引物、底物與模板之間的準(zhǔn)確配對，另外，60可在pr實驗條件下活化生成多種活性氧或自由基，進而造成dna聚合酶構(gòu)象的改變以及dna模板的損傷，抑制了pr反響的進展。2.5半導(dǎo)體納米材料對pr體系的影響nie等36發(fā)現(xiàn)外表帶氨基的si2包覆的四足狀zn納米構(gòu)造能進步

17、pr擴增的產(chǎn)量。由si2包覆的四足狀zn，當(dāng)外表有氨基修飾并且參加量由0.01g逐漸增大到0.5g時，pr產(chǎn)物的量不斷增多；當(dāng)參加量0.5g時，pr產(chǎn)物的量卻不再增加。外表修飾了氨基的zn納米構(gòu)造在一定濃度范圍內(nèi)能進步pr擴增的產(chǎn)量。當(dāng)外表沒有氨基修飾，zn納米構(gòu)造的量0.06g時，pr產(chǎn)物的量變化不大；而當(dāng)zn納米構(gòu)造的量0.12g時，pr產(chǎn)物的量減少。其反響機理還不明確。ang等37考察了外表修飾了羧基的dte量子點對pr體系特異性的影響。實驗結(jié)果說明，在不同的退火溫度下，dte量子點能進步pr體系的特異性，而且在擴增短片段時，量子點對pr體系特異性的進步比擴增長片段時進步的更明顯。同時，

18、dte量子點不能進步pr的效率。dte量子點可以作為常規(guī)pr的優(yōu)化因子，尤其是對多重pr，因此可以拓寬pr的應(yīng)用范圍，同時也對基因診斷具有重要的意義。他們認為反響機理可能有兩方面：1與金納米粒子相似，dte量子點模擬了體內(nèi)dna復(fù)制過程中單鏈結(jié)合蛋白ssb的作用，選擇性地結(jié)合了單鏈dna，從而顯著降低了dna復(fù)制過程中引物和模板的錯配，有利于進步pr的特異性；2dte量子點可能與dna聚合酶發(fā)生了互相作用，聚合酶吸附到量子點的外表，使pr體系中聚合酶的有效濃度降低，從而有利于目的產(chǎn)物的產(chǎn)生，進步了pr的特異性。但隨著量子點的不斷增多，聚合酶濃度不斷降低，當(dāng)聚合酶濃度小于特異擴增需要的有效濃度時

19、，量子點的參加又會對pr產(chǎn)生抑制作用。另外，還有不少學(xué)者研究了半導(dǎo)體納米材料對pr體系的抑制作用。早期有學(xué)者將微米級的硅顆粒以及外表經(jīng)過處理的硅參加到pr體系中38，39，發(fā)現(xiàn)微米級的硅對pr過程有較明顯的抑制作用。王瑋等40將納米級的硅引入pr體系中，討論了外表氧化程度不同的硅納米顆粒對pr擴增的抑制作用及其機理。實驗結(jié)果說明，隨著硅材料外表積與pr反響體系體積比的增大，核酸擴增效率明顯下降；并且在所研究的范圍內(nèi)，外表氧化程度越高的硅納米顆粒對pr的抑制作用越強。對抑制作用機理的初步研究說明，硅納米顆粒對pr反響液中taq酶的吸附是導(dǎo)致抑制現(xiàn)象產(chǎn)生的主要原因。而對模板的吸附對pr的影響較小，

20、而且，硅納米顆粒本身對pr沒有明顯的直接化學(xué)抑制作用。李世強等41考察了在避光條件下，銳鈦礦型納米ti2對pr體系的影響，結(jié)果說明，納米ti2對pr體系有抑制作用。隨著納米ti2量的增加，對dna合成的抑制也越強，且抑制作用強于微米級的ti2。將預(yù)先分別與納米ti2作用的聚合酶、引物和模板參加到pr體系中，聚合酶的上層清液、引物的沉淀、模板的上層清液與沉淀均有dna的合成，但合成量均小于納米ti2直接參加pr的dna的合成量。他們認為在避光下，銳鈦礦型納米ti2抑制dna合成的主要原因是納米ti2具有高的比外表積，對聚合酶、引物和模板存在較強的吸附作用，對引物的吸附作用最強，對聚合酶的吸附最弱

21、。3總結(jié)與展望將納米材料引入到聚合酶鏈反響中，可以同時發(fā)揮納米材料和dna的優(yōu)點，極大地拓寬pr技術(shù)的應(yīng)用范圍。將納米材料用于pr體系中，進步了pr的特異性，增加了產(chǎn)量；拓寬了pr的退火溫度范圍，使pr在低至25時也能退火；有利于小片段dna的擴增；可以代替緩沖液中g(shù)2的作用。預(yù)計今后的相關(guān)研究將會側(cè)重于以下幾個方面：1尋找有利于大片段dna擴增的納米材料。目前研究發(fā)現(xiàn)納米金對pr的促進作用是更有利于小片段dna1kb以下的擴增。而在實際應(yīng)用中，大片段dna的擴增非常重要。如今基因克隆研究中，長片段以及超長片段dna10kb以上的擴增還不能獲得滿意的效果，主要原因是酶在pr較高的變性溫度下94

22、長時間的工作，會出現(xiàn)活性降低甚至失活，因此研究納米材料對pr變性溫度的影響具有重要意義。通過納米材料來降低pr的變性溫度或者增強聚合酶的耐高溫性質(zhì)來實現(xiàn)長片段擴增的理想效果，是今后的一個研究方向；2尋找新的納米材料來實現(xiàn)聚合酶的可控定量供給。細胞內(nèi)有一整套參與反響的分子數(shù)量的定量控制體系，尤其是各種生物酶。而在pr中，模板呈指數(shù)增長，對各反響組分尤其是聚合酶的需求也在變化，聚合酶缺乏會降低dna的合成量，過量又易引發(fā)非特異擴增。通過納米材料來調(diào)控pr過程中聚合酶的量，將有望解決如今pr技術(shù)中存在的假設(shè)干問題；3使用人工納米材料將聚合酶和pr的其它各反響成分連接起來，使其充分接觸反響，從而進步p

23、r反響效率；4根據(jù)pr體系各種抑制劑的作用機制的不同，引入外表修飾有各種官能團的人工納米材料，與各種抑制劑反響，消除其對pr體系的負面影響。【參考文獻】1ulliskb，falnafa.ethdsenzyl.，1987，155：3353502henrj，zhangyg，angd，daihj.j.a.he.s.，2001，12316：383838393dyer，guthld，falv，ashburns，superfiner，eried.nantehnlgy，2002，13(5)：6016044lihx，rthberglj.j.a.he.s.，2022，126(35)：10958109615inu

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