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1、實驗四 PCR產(chǎn)物的T載體克隆和轉(zhuǎn)化 實驗?zāi)康模簩W(xué)習(xí)T載體的特點和PCR產(chǎn)物的克隆方法。實驗要求：掌握利用T載體克隆PCR產(chǎn)物的方法；復(fù)習(xí)連接實驗流程。技術(shù)應(yīng)用：方便、易行的克隆PCR產(chǎn)物，使目的基因片段與T載體DNA連接，達到克隆基因的目的。1材料：目的基因片段的PCR產(chǎn)物藥品：TVector KIT （Invitrigen公司） ， ddH2O2實驗原理普通Taq酶會在3末端加一個A，這樣所有PCR產(chǎn)物都會在雙鏈DNA的3端均有一個單鏈狀態(tài)的A；T載體是線狀DNA片段，在DNA雙鏈的3端均有一個單鏈狀態(tài)的T；二者在連接酶的作用下連接為一個重組的環(huán)狀分子，從而達到克隆的目的。T+a t t+

2、t a+a t+a+T+A3pGMT 載體的結(jié)構(gòu)4pMD18T 載體的結(jié)構(gòu)5實驗步驟（1）目的片段的制備膠回收法回收PCR產(chǎn)物：6實驗步驟（1）目的片段的制備膠回收法回收PCR產(chǎn)物：7(2)連接實驗：反應(yīng)體系如下：在0.5mlEppendorf 管加入以下試劑： 目的片段（0.1ug/ul） 7l 載體DNA（0.1ug/ul） 1l Ligase 1l 10Ligase Buffer 1l Total 10 L 備注：瞬時離心，混合均勻。4連接416 小時，-20儲存或直接用于轉(zhuǎn)化。8說明1. 回收DNA片段可以用沉淀法，但是只適用于PCR擴增產(chǎn)物為單一片段，而且需要檢測PCR擴增結(jié)果后進行；2. 此種連接方法是根據(jù)普通Taq酶會在3末端加一個A的原理發(fā)明的；注意不同的酶的性能不同，保真性強的Taq酶會自動切除末端的A，所以，這種酶的擴增產(chǎn)物需要補加A后再連接

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