圓二色譜原理

1、關(guān)于圓二色譜原理第一張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月光學活性分子對左、右圓偏光的吸收率的差值第二張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月1、自然光光具有波、粒二象性，是橫電磁波。只有橫波才有偏振現(xiàn)象: 光矢量的振動方向與光的傳播方向垂直， 在垂直于光傳播方向的平面內(nèi), 有不同的振動方向。電場矢量E和磁場矢量H互相垂直、位相相同。v0HE第三張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月由于感光作用都是E 引起的，因而，將E 作為光矢量。振動面：E 與光傳播方向組成的平面。E傳播方向振動面第四張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月從統(tǒng)計規(guī)律上說，自然光的光振動: 在垂直于光速的平面上

2、遍布所有方向， 沿各方向振動的光矢量呈對稱分布, 相應光矢量的振幅（光強度）相等。第五張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 （1）高亮度的點光源；（2）日光色。色溫接近6000K；（3）在可見光區(qū)連續(xù)光譜；（4）高顯色性，顯色指數(shù)95；（5）在整個壽命期內(nèi)維持光色特性；（6）高電弧穩(wěn)定性；（7）熱重啟能力；（8）啟動后即能達到接近最大光輸出；（9）電弧光斑小、易聚光。超高壓短弧氙燈: 在高壓純凈氙氣中放電發(fā)光。第六張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月自然光平面偏振光圓偏振光樣品橢圓偏振光第七張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月雙折射現(xiàn)象： 一束光射入各向異性晶體后有兩束折射光

3、。 尼科耳棱鏡。 2、光的偏振 在生物樣品中，肌肉纖維、骨骼和牙齒等具有各向異性，淀粉粒、染色體和紡錘體等具有雙折射性，因此被用于組織細胞的化學研究。第八張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月名稱折射定律折射率傳播方向?qū)こ９猓╫光）遵守對于晶體一切方向都具有相同的折射率在入射面內(nèi)非常光（e光）不遵守折射率隨方向而變化不一定在入射面內(nèi)第九張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月o光和e光：頻率相同、振動方向相互垂直、平面偏振光第十張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月自然光入射到某些晶體（電氣石、硫酸金雞鈉堿晶體等）時，晶片吸收振動面與晶軸垂直的光，而只允許振動面平行于晶軸的光通過。第

4、十一張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月自然光平面偏振光起偏器檢偏器晶軸相互平行時，透射光強度最大；晶軸相互垂直時，透射光強度為零；晶軸夾角為時，透射光強度與cos2成正比。.第十二張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月也稱線（完全）偏振光，簡稱偏振光。它的振動面稱為其偏振面。振動方向保持不變振幅發(fā)生周期性變化E之端點在空間的軌跡為一平面正弦曲線投影到垂直于光傳播方向的平面上為一直線段3、平面偏振光（Plane polarized light）第十三張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月4、布儒斯特角當入射光射到兩種介質(zhì)界面上時，反射光和折射光的偏振情況與入射光不同。第十四張，P

5、PT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月5、四分之一波片使o光和e光的光程相差1/4波長的晶片。此時，相位差為/2，透射的合成光是長軸與晶軸重疊的正橢圓偏振光。第十五張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月朝光源看， 電場矢量方向按順時針方向旋轉(zhuǎn)的，稱為右圓偏振光； 電場矢量方向按逆時針方向旋轉(zhuǎn)的，稱為左圓偏振光。若入射平面偏振光的電矢量與晶體晶軸的夾角45，則Eo = Ee，合成光是圓偏振光（Circular polarized light）。第十六張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月6、光的疊加一束自然光可以看作是兩束相互垂直而沒有相位關(guān)系的平面偏振光的加和。第十七張，PPT共七十二頁

6、，創(chuàng)作于2022年6月旋轉(zhuǎn)方向相反的左、右圓偏光透過一光學活性物質(zhì)后透過的左、右圓偏光振幅相位矢量和相等相同平面偏振光相等不同平面偏振光，方向改變不等相同橢圓偏振光不等不同橢圓偏振光，方向改變第十八張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月振幅相等、振動方向相互垂直、相位相差1/4波長的兩平面偏振光合成圓偏振光右旋第十九張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月7、旋光色散（Optical rotatory dispersion，ORD）旋光性：光學活性分子對左、右圓偏光的折射率不同，透射光雖然仍然為平面偏振光，但其偏振面旋轉(zhuǎn)了一定的角度。 旋光物質(zhì)又稱為光學活性物質(zhì)。旋光度：偏振面旋轉(zhuǎn)的角度

7、 旋光色散：不同波長的偏振光的旋轉(zhuǎn)角度不同。 旋光儀是測量旋光性與波長的函數(shù)關(guān)系，從而得到一個旋光色散譜。第二十張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月圓雙折射：某個物質(zhì)對于左、右圓偏光的折射率分別為nL和nR， 若 nL = nR，則為光學各向同性物質(zhì)； 若 nL nR，則為光學各向異性物質(zhì)；左、右圓偏光的相位改變， 若nLnR，透射光的偏振面右旋。 若nLnR，透射光的偏振面左旋。旋光現(xiàn)象是圓雙折射的一種特殊形式。旋光物質(zhì)使左、右圓偏振光的速度不同，即其色散大小的折射率不同，旋光現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于光學各向異性物質(zhì)的折射率nLnR的結(jié)果。第二十一張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月旋光

8、，雙折射第二十二張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月化合物在正常情況下，處于低能的基態(tài)，電子占據(jù)所有的成鍵軌道（、n軌道）。如果電子吸收了外界的能量，它就從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)能級。如果所有的躍遷僅在基態(tài)的最低振動能級和第一激發(fā)態(tài)之間，吸收光譜將是很狹窄而不連續(xù)的譜線。由于分子的價電子躍遷總伴隨著振動和轉(zhuǎn)動能級的躍遷，所以，紫外分光光度計測定物質(zhì)的吸收光譜，雖然有一最大吸收峰值，但都是具有一定波長寬度并相對平滑的曲線。8、光的吸收和圓二色性（circular dichroism, CD）第二十三張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月光的吸收若溶液中的溶質(zhì)對某一波長的入射光有吸收，則透射光

9、的光強度小于入射光。第二十四張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月圓二色性的存在將通過該物質(zhì)傳播的左、右圓偏光變成橢圓偏振光。并且只在發(fā)生吸收的波長處才能觀察到。第二十五張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月理論計算的圓二色性與該橢圓偏振光的摩爾橢圓率的關(guān)系： = 100/（c l） = 3300（ L-R）：介質(zhì)對圓偏振光的摩爾消光系數(shù)， c ：樣品摩爾濃度， l ：樣品厚度（cm ）， 單位：/（mol cm） 或 cm2/dmol。第二十六張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月圓二色性的表示吸收（率）差 = L - R A = AL AR 橢圓度，摩爾橢圓度 = 2.303（

10、AL AR）/4 = 3298（L - R） 3300 （L - R） 在蛋白質(zhì)研究中，常用平均殘基摩爾橢圓度第二十七張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月園二色雙折射第二十八張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月9、ORD與CD光譜同時產(chǎn)生，包括同樣的分子結(jié)構(gòu)信息：光學活性物質(zhì)分子中的不對稱生色團。CD反映光與分子間能量的交換，旋光性則是與分子中電子的運動有關(guān)。可以由Kronig-Krammers轉(zhuǎn)換方程相互轉(zhuǎn)換。第二十九張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月CD譜的極值處與吸收峰一致（科頓效應，cotton effect），因而分子中不同生色團對于譜的貢獻比在ORD中更容易分辨

11、。ORD是漸近線，兩端不回歸ORDCD吸收帶附近，旋光度由負到正正Cotton效應正CD帶吸收帶附近，旋光度由正到負負Cotton效應負CD帶第三十張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月CD比ORD容易辨別重疊峰CD比ORD弱帶易檢測CD比ORD更容易擬合CD比ORD提供較多意義明確的信息表明有三個生色團，其中兩個有光學活性第三十一張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月CD能夠提供的信息：primary structure, secondary structuretertiary structureAlpha-helix,beta-sheet肽鏈骨架的構(gòu)象變化蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜主要有

12、兩個峰：190-250nm：肽鍵280-290nm：酪氨酸t(yī)yr，色氨酸t(yī)rp第三十二張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月10、 J-810圓二色光譜儀S1-S2:第一級單色器；S2-S3:第二級單色器;M：球面反光鏡；P：晶體石英棱鏡；L:透鏡；F:濾光器；第三十三張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月由CDM交互形成的左、右旋圓偏光通過光學活性物質(zhì)，透射光強度隨時間的變化當調(diào)制電壓過其峰值（正和負）時，RL時，透過的右旋圓偏光的光強對應于最大值，而左旋最?。▽嵕€）；RL時，透過的左旋圓偏光的光強對應于最大值，而右旋最?。ㄌ摼€）。PMT的輸出信號由正比于IA的直流分量和正比于S的交

13、流分量所組成。直流成分IA=（IL+IR）/2交流成分S相當于圓二色性透射光強的變化頻率與外加調(diào)制電壓的頻率相同。第三十四張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月圓二色光譜儀工作原理用相同強度，相同頻率的左、右旋圓偏光交替照射樣品測得透過樣品后的強度IR和IL由于IR和IL十分接近，令I(lǐng)A=（IL+IR）/2，S= IR IL只放大相應于S的PMT輸出電壓Es（交流信號），而不放大相應IA的輸出電壓EA。（適當選取放大倍數(shù)G值，使ESG與EA可比）。第三十五張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Peltier Cell HolderCD/Total FluorescenceFMOStop

14、ped Flow-20200 第三十六張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月The peptide bond is inherently asymmetric and is always optically active蛋白質(zhì)的光學活性第三十七張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月1、氨基酸的圓二色性可見光區(qū)：各種氨基酸都沒有光吸收。紫外光區(qū)：只有芳香族色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有吸收。氨基酸分子內(nèi)的紫外生色基團：吲哚基、酚羥基、苯基、二硫鍵、咪唑基和羧基等。第三十八張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月2、肽的圓二色譜活性肽構(gòu)象與其生理功能的關(guān)系肽的構(gòu)象也是蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種模型。肽

15、的圓二色性為研究肽在溶液中的構(gòu)象提供了重要信息。第三十九張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Far-UV (250-170nm) Secondary Structure: -helix, -sheet, -turn, random Tertiary Structure Class: all-, +, /, all-I, all-IINear-UV (320-250nm)： aromatic side chainNear-UV Near-infrared (300-1000nm)： colored proteins第四十張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月苯丙氨酸（ phenylal

16、anine， Phe）：255、261和268nm附近；酪氨酸（ tyrosine， Tyr） ：277nm左右；色氨酸（ tryptophan， Trp） ： 279、284和291nm附近；二硫鍵的變化反映在整個近紫外區(qū)。 芳香氨基酸殘基及二硫鍵處于不對稱微環(huán)境時，在近紫外區(qū)表現(xiàn)出CD信號第四十一張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Far UV CD spectra of poly-L-Lys1、100% -螺旋2、100% -折疊3、100%無規(guī)卷曲第四十二張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月- band (nm)+ band (nm)-helix 222208192-she

17、et216195-turn220-230 (weak)180-190 (strong)205polypro II helix190210-230 weakRandom coil200212Main CD features of protein 2ndary structures 第四十三張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月3、估算蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量僅適合含量較高的蛋白質(zhì)！將測得的CD曲線與標準曲線擬合。xa+ xb + xc = 1.0qt = xaqa + xbqb + xcqc改變xa、xb和xc，使qt與樣本曲線最佳擬合（最小二乘法，least squares minimizati

18、on ）未知結(jié)構(gòu)的蛋白的CD信號第四十四張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月myoglobin qt = xaqa + xbqb + xcqcfits best with xa = 80% xb = 0%xc = 20% agrees well with structure 78% helix, 22% coilFor further details: /cd/cdtutorial.htm第四十五張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月GCN4-p1 0oC：100% helix75oC：0% helixwhat about 50oC? qt = xoqo + x75q75fits b

19、est with xo = 50% x75= 50%Shows that at 50oC1/2 of peptide a-helix dimer1/2 of peptide random coil monomer第四十六張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 Lau, Taneja and Hodges (1984) J.Biol.Chem. 259:13253-13261螺旋二聚體分解為單螺旋三氟乙醇 （trifluoroethanol，TFE）誘導肽鏈形成螺旋TFE對卷曲螺旋（coiled-coil）的影響 第四十七張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月 chymotrypsin

20、(all b) lysozyme (a + b) triosephosphate isomerase(a/b) myoglobin (all a)CD signal of a protein depends on its 2ndary structure第四十八張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十九張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月pH變化引起的肌球素變性前后CD譜的動力學變化第五十張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月稀釋前后的熒光和CD譜從伸展到折疊螺旋含量的變化的動力學檢測Kinetic Trace at 222nm(secondary structure reg

21、ion)Unfolding state (random)Refolding state (-Helix)第五十一張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Kinetic traces at 289nm (Aromatic side chain region)細胞色素c伸展和折疊狀態(tài)的CD和熒光光譜反映了芳環(huán)側(cè)鏈（色氨酸殘基）的變化鹽酸胍中的細胞色素c(伸展狀態(tài)) 與PBS混合后的CD和熒光光譜第五十二張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月6、磁圓二色譜（ Magnetic Circular Dichroism ，MCD）磁性材料對左、右圓偏光的吸收不同而產(chǎn)生的二色性現(xiàn)象。利用法拉第效應，在

22、外加磁場的作用下，許多原來沒有光學活性的物質(zhì)也具有了光學活性，原來可測得CD譜的，在磁場中CD信號可增大幾個數(shù)量級。7000 Gauss 第五十三張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月實驗要點第五十四張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Sample concentrationA good suggestion is to run in advance an absorption UV-VIS spectra.CD spectroscopy calls for same requirements as UV-VIS: best S/N is obtained with absorban

23、ce level in the range 0.6 to 1.2. Its usually difficult to get proper data when absorbance (of sample + solvent) is over 2 O.D.第五十五張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月樣品杯：高度均勻的熔融石英，不會帶來附加的圓二色性。光程：0.01cm-1cm，為了降低溶劑影響，一般提高樣品濃度，用短光程。cell pathlength第五十六張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Nitrogen flushingFlushing the optics with dry

24、 nitrogen is a must:Xe lamp has a quartz envelope, so if operated in air itll develop a lot of ozone, harmful for the mirrorsbelow 195nm oxygen will absorb radiation第五十七張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月HT plotThe HT plot is very important, since readings above 600-650V mean that not enough light is reaching the

25、 detector so a sample dilution or the use of shorter path cell are required.the HT plot is in realty a single beam spectra of our sample, since there is a direct relation between HT and sample absorbance. By data manipulation HT conversion into absorbance and buffer baseline subtraction is possible.

26、 Alternatively single beam absorbance scale can be used already in CH2 during data collection, loosing however a bit the alerting functions of this channel.第五十八張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月第五十九張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Bandwidth (SBW) selectionSetting of slits should be as large as possible (to decrease noise le

27、vel), but compatible to the natural bandwidth (NBW) of the bands to be scanned.As a rule SBW should be kept at least 1/10 of the NBW, otherwise the band will be distorted.If NBW is not known a series of fast survey spectra at different SBW will help proper selection. Trade in of accuracy versus sens

28、itivity (i.e. the use of larger than theoretical SBW) is occasionally required.2 nm in the far UV region1 nm in the aromatic region (where fine structures may be present), optimal band-pass (as large as possible, but not loosing information) can be determined after a trial第六十張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月標準操

29、作時譜帶寬度選為1nm；高分辨率測量用較窄的狹縫寬度，此時PMT電壓較高，信噪比差；當樣品的光密度很高、CD很小時，就要保持測試CD峰多需要的足夠濃度，并用較寬的狹縫寬度。此時，由于樣品OD值過高，可能存在有熒光或雜散光引起的某些假象。第六十一張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Number of data pointdata pitch, i.e. number of data points per nm, will not directly influence the noise level. However if post run further data processing w

30、ill be applied to reduce the noise, its advisable to collect as many data points as possible to increase the efficiency of the post run filtering algorithm第六十二張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Accumulationanother way to improve S/N is to average more spectra. Here too the S/N will improve with the square root of

31、 the number of accumulations.Averaging is very effective since it compensates short term random noise, but itll not compensate long term drifts (mainly of thermal origin). So if long accumulations are used we recommend a suitable long warm-up of the system and/or the use of a sample alternator (to c

32、ollect sequentially sample and blank and average their subtracted values).For long overnight accumulations its essential that room temperature is well kept stable.第六十三張，PPT共七十二頁，創(chuàng)作于2022年6月Buffer Systems for CD AnalysesAcceptable:1. Potassium Phosphate with KF, K2SO4 or (NH4)2SO4 as the salt.2. Hepes, 2mM.3. Ammoniu