藥品微生物檢驗及無菌檢測

1、藥品微生物檢驗及無菌檢測地址：北京市天壇西里2號 郵編：100050 蒲公英論壇：1藥品微生物檢驗特點及過程控制藥品因素環(huán)境影響培養(yǎng)觀察抽樣檢查破壞試驗方法驗證（氟康唑）過程控制2無菌/微生物限度檢查理念環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗證SOP操作有效的結果可靠的結論結果判斷3一、實驗設施實驗室系統(tǒng)操作環(huán)境關鍵設備對照培養(yǎng)基物 質 保 障4（一）、實驗室系統(tǒng)潔凈實驗條件有效性：整體10000級、局部100級。安全性：保護樣品、人員和環(huán)境?？刹僮餍裕悍奖?、快捷、順暢。潔凈實驗條件的維護、驗證陽性菌實驗室達到P2生物安全標準5（一）、實驗室系統(tǒng)實驗室系統(tǒng)的管理與維護：1、屏障

2、系統(tǒng)的有效性 壓差、風速、微粒、照度 （外包服務合同）2、清潔、靜態(tài)與動態(tài)監(jiān)控、熏蒸3、環(huán)境菌庫 酒精棉球分離微生物 新潔爾滅分離微生物 酸堿苯酚6環(huán)境菌庫潔凈環(huán)境常見菌（浮游菌）：頭狀葡萄球菌（Staphylococcuscapitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）緩癥鏈球菌（Streptococcusmitis）科氏葡萄球菌（Staphylococcuscohnii）藤黃微球菌（Micrococcusluteus）一般使用的陽性對照：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC(B)26003銅綠假單胞菌（Pseudomona

3、s aeruginosa）CMCC(B)10104生孢梭菌(Clostridium sporogenes)CMCC(B)64941枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CMCC(B)63501白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F)98001黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC(F)980037（二）、操作環(huán)境1、隔離器2、生物安全柜3、超凈工作臺8（二）、操作環(huán)境9（三）、關鍵設備 微生物檢查薄膜過濾儀 一次性薄膜過濾培養(yǎng)器應急檢驗用一次性薄膜過濾培養(yǎng)器10（四）、對照培養(yǎng)基 培養(yǎng)基適用性（靈敏度）； 培養(yǎng)基性能穩(wěn)定性（標準化）。對照培養(yǎng)基理化

4、評價（可控性）生物學評價（有效性）回收率比較MPN比較生長曲線比較生態(tài)評價某些CRS原則固態(tài)培養(yǎng)基液態(tài)培養(yǎng)基瓊脂加減法11二、檢驗程序環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗證SOP操作有效的結果可靠的結論結果判斷12二、檢驗程序接受任務實驗方案實驗準備樣品核對實驗操作過程監(jiān)控培養(yǎng)觀察有效的結果物 質 保 障13（一）、實驗準備實驗準備應堅持“平戰(zhàn)結合”，物質準備有備無患，應隨時保證“來之能戰(zhàn)” 。尤其注意常備有效期要求的物品：培養(yǎng)基、沖洗液、濾器、小型實驗器材等。14實驗準備無菌室專用酒精棉球制備實驗準備場地清潔實驗準備臺面清潔15（二）、樣品核對盡快取得樣品，確保樣品傳遞過程

5、中的完整性、安全性、有效性；仔細核對樣品及樣品資料，高度關注媒體公布樣品（問題樣品），同時盡量獲取非問題樣品及同類樣品，進行比較實驗、比較分析；樣品外觀檢查、完整性檢查。16樣品外觀檢查欣弗樣品外觀檢查刺五加樣品外觀檢查雙黃連樣品完整性真空檢漏17（三）、實驗操作不斷完善標準化操作規(guī)程（SOP），嚴格避免實驗室污染。實驗人員 培養(yǎng)基實驗器材實驗環(huán)境檢驗結果待檢樣品原料 輔料 設備環(huán)境藥品（食品）人員 藥品食品生產過程中可能污染微生物的主要環(huán)節(jié)藥品食品微生物檢查過程中可能污染微生物的主要環(huán)節(jié)18三、結果判斷長菌與否分離鑒定溯源調查結果報告可靠的結論有效的結果物 質 保 障19三、結果判斷 是不是

6、微生物？ 是什么微生物？ 微生物來自哪里？ 幾點思考 參見：FTIR法用于藥品檢出菌與藥品微生物檢驗潔凈室環(huán)境菌的相似性考 察藥學學報，2007，42（11）：11891194 判斷無菌檢查陽性結果有效性的實驗探討藥物分析雜志， 2008， 28（05）：6671 201、長菌與否？渾不渾濁?物理變化、化學變化還是生物變化？一靠經驗二靠實驗三靠嚴格程序控制避免干擾21是不是微生物？（1）、液體培養(yǎng)基渾濁 物理變化？化學變化？生物學變化？（2）、平板上的菌落 瓊脂表面、瓊脂中、瓊脂和平皿夾層 菌落or藥渣？22菌落or藥渣？經60Co射線大劑量照射再檢驗延長培養(yǎng)時間到7天重新劃線培養(yǎng)鏡檢232、

7、分離鑒定（1）立即轉接2ml該培養(yǎng)物至相同的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；（2）取5支凍存管，每管分裝1ml渾濁培養(yǎng)物，-80保存；（3）取渾濁培養(yǎng)物在TSA平板/血瓊脂上劃線，分離污染微生物；（4）如果發(fā)現硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)管變渾濁，還應增加血平板劃線，并在厭氧條件下培養(yǎng)分離厭氧菌。由平板分離到的菌落應進一步鑒定，并逐一保藏。24是什么微生物？宏觀：生長形態(tài)微觀：鏡檢鑒定：生化鑒定（API、BD） 核酸鑒定（16sRNA、DNA） 253、溯源調查樣品陽性培養(yǎng)物分離菌株檢驗過程監(jiān)控菌株環(huán)境菌（近期、遠期）現場調查收集菌株鑒定與相似性分析相結合傳統(tǒng)方法與新技術相結合不同方法的交叉驗證26微生物來自哪里？

8、相似性分析 同源性分析 脈沖場電泳（PFGE）、傅立葉紅外（FTIR） 2728溯源性分析例1欣弗事件 頭狀葡萄球菌頭狀亞種（Staphylococcuscapitis ssp capitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）緩癥鏈球菌（Streptococcusmitis）科氏葡萄球菌科氏亞種（Staphylococcuscohnii sspcohnii）藤黃微球菌（Micrococcusluteus）溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）。監(jiān)測到的環(huán)境菌株29溯源性分析例2編號BD鑒定走廊1B.pumilus 走廊2M.lu

9、teus 走廊3/無菌室4C.urealyticum 無菌室5K.kristinae 無菌室6C.urealyticumC1524-FS.caprae C1524-BS.caprae C1525-B1-1S.warneri C1525-B1-2S.epidermidisC1525-B2S.warneriC1525-F1S.warneriC1525-F2-1S.capitisC1525-F2-2S.epidermidisC1526-B1C.urealyticumC1526-B2S.warneriC1526-F1S.epidermidis C1526-F2S.haemolyticus菌株16sRN

10、A鑒定可信度C1524-FS. haemolyticus99%C1524-BS. haemolyticus98%C1526-F2S. haemolyticus100% 雙黃連注射液 利巴韋林注射液 FTIR相似性分析 DuPont RiboPrinter基因指紋分析30幾點思考（1）、怎樣才算是同一株菌？ 需要深入認識微生物本身 微生物變異與保守的相對性； 分析方法的可變性與微生物本身的可變性；生物學先鋒琳恩馬古利斯(Lynn Margulis)曾表示：“如果將一個特殊的質粒植入大腸桿菌，大腸桿菌便會突然間變成克雷伯氏桿菌”。 31幾點思考（2）、什么是最適宜的技術？ 需要深入認識分析微生物的

11、技術和手段 形態(tài)學分析與相似性分析（生化反應譜、片段相似性、FTIR光譜相似性等），在權衡方法本身的邊界和微生物變異性邊界的基礎上，似乎更適合對親緣關系下一個否定的結論，即排除法，在這個意義上是否可以引入化學分析的3概念、精密度概念？ 324、幾點思考（2）、什么是最適宜的技術？ 16sRNA cDNA序列，需要研究，太保守不利于區(qū)分；變異率太高（高到普通傳代、培養(yǎng)難以控制）則沒有意義。但一般來說16sRNA cDNA序列水平具有確定意義，困難在于確定足夠長。 溯源分析不僅僅是鑒定到種，而是到株，對菌株的穩(wěn)定性認識？與之相關的技術粗放性問題。 334、幾點思考（3）、怎樣下結論？ 分析的根本目的是要下一個結論 以檢驗活動為中心、以檢驗過程為線索、以實 驗事實為依據，根據所有信息的綜合分析能力。 對陽性檢出菌的技