寄生蟲低溫保存的研究現(xiàn)狀

1、寄生蟲低溫保存的研究現(xiàn)狀王愛民 周國燕 （上海理工大學(xué)低溫醫(yī)學(xué)與食品冷凍研究所，中國 上海 200093）摘要：低溫保存寄生蟲可消除傳統(tǒng)保存方法的弊端，并可保持寄生蟲原有的生物學(xué)特性。本文綜述了寄生原蟲和蠕蟲低溫保存的研究現(xiàn)狀，著重從低溫抗凍劑、降溫過程和復(fù)溫過程三個方面，探討了不同寄生蟲低溫保存的最佳工藝，分析得出低溫抗凍劑、冷凍速度和融凍速度是影響保存損傷程度的主要因素，為寄生蟲低溫保存研究提供理論幫助，并指出今后研究的方向。關(guān)鍵詞：寄生蟲，低溫保存，低溫抗凍劑，降溫，復(fù)溫The Research Progress of Cryopreservation of ParasitesWANG

2、Ai-min ZHOU Guo-yan(Institute of Cryo-medicine and Food Refrigeration, Shanghai University of Science and Technology， Shanghai 200093, China ) Abstract: The cryopreservation of parasites not only can eliminate limitations, but also can maintain the original biological characteristics of parasites. I

3、n this paper, the research progress of cryopreservation of protozoa and worms parasites is summarized, of which the cryoprotectant, freezing processes and thawing processes are mainly discussed. And the conclusion is got that the most important factors of cryopreservation of parasites are cryoprotec

4、tant, freezing and thawing rates. Some key subjects of further research are pointed out. Keyword: cryopreservation, parasites, cryoprotectant, freezing processes, thawing processes寄生蟲1是寄生在另一種動物體內(nèi)來獲取維持其生存、發(fā)育和繁殖所需的營養(yǎng)物質(zhì)，并對寄生動物造成損害的一種生物。十九世紀(jì)二三十年代，人們開始研究犬惡絲蟲微絲蚴和猴瘧原蟲紅內(nèi)期保存。傳統(tǒng)的寄生蟲保存方法2,3有體外培養(yǎng)和動物轉(zhuǎn)種，這些方法價格昂貴，

5、繁瑣，而且有一定的風(fēng)險，往往容易發(fā)生遺傳漂變、人為差錯或混淆等問題。隨著冷凍技術(shù)的發(fā)展以及液氮的使用，寄生蟲的低溫保存技術(shù)也發(fā)展起來。低溫保存技術(shù)不僅能消除傳統(tǒng)方法存在的弊端，而且能延長存活時間，保持原有的生物學(xué)特性。低溫保存寄生蟲可用于寄生蟲的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生活史、致病性以及寄生蟲病的藥物篩選、免疫診斷和免疫預(yù)防，也為建立“寄生蟲庫”提供了簡便、實用而有效的方法，具有重要的使用價值和經(jīng)濟意義。本文著重從寄生蟲的種類及低溫保存技術(shù)兩大方面闡述低溫保存寄生蟲的最新研究進(jìn)展，并探討該領(lǐng)域今后研究的主要方向。1 寄生蟲低溫保存的種類近些年來，寄生蟲的低溫保存研究主要是原蟲和蠕蟲，它們因種類及發(fā)育階段的不

6、同所表現(xiàn)出的低溫忍耐力也不盡相同。寄生原蟲低溫保存的研究原蟲類是寄生蟲低溫保存中研究比較早的一個種類，在20世紀(jì)70年代出現(xiàn)了許多與此有關(guān)的研究報道4。目前，有關(guān)原蟲類低溫保存的研究報道很多，主要有利什曼原蟲、瘧原蟲、弓形蟲等。成功保存利什曼原蟲前鞭毛體以及感染杜氏利什曼原蟲的地鼠組織后，學(xué)者對利什曼原蟲的低溫保存進(jìn)行了更多的研究5。瘧原蟲的研究早期主要集中在紅內(nèi)期和子孢子器，到20世紀(jì)70年代，成功用伯氏鼠作為載體低溫保存瘧原蟲，隨后在90年代瘧原蟲配子體成功保存6。這些成果為惡性瘧原蟲的體外連續(xù)培養(yǎng)奠定了基礎(chǔ)，也為隨后的體外篩選、抗體疫苗的研究以及基因組的研究提供了很大的方便。之后研究者對

7、瘧原蟲的低溫保存條件進(jìn)行了更多研究，如用血液或者動物組織進(jìn)行低溫保存，并探討了不加抗凍劑的低溫保存的方法7。弓形蟲的低溫保存已經(jīng)很普遍 8,9，主要研究速殖子，大多采用感染小鼠腹水加抗凍劑進(jìn)行保存。其它原蟲類的寄生蟲如阿米巴原蟲、人毛滴蟲等的低溫保存也有研究。如Fulton10等人用甘油作抗凍劑，成功的對阿米巴滋養(yǎng)體進(jìn)行了低溫保存。寄生蠕蟲低溫保存的研究目前，寄生蠕蟲的低溫保存研究主要針對三個階段：蟲卵、幼蟲、成蟲。其中絲蟲、吸蟲的研究比較全面。絲蟲是研究比較早的品種。在20世紀(jì)60年代以前，絲蟲的冷凍以不加任何抗凍劑為主，且多數(shù)集中在絲蟲微絲蚴方面11,12，60年代以后對添加低溫抗凍劑進(jìn)行

8、了探索。首先使用的是DMSO，進(jìn)行冷凍保存實驗，效果很好。70年代以后，抗凍劑等因素被廣泛考慮，并開始研究各種類絲蟲微絲蚴的低溫保存13。如彭亨絲蟲微絲蚴、馬來絲蟲微絲蚴、多種盤尾微絲蚴、旋盤尾絲蟲，都獲得了成功。但對于絲蟲成蟲的低溫保存到80年代才開始有報道14。寄生吸蟲的低溫保存，James15較系統(tǒng)地對曼氏血吸蟲童蟲進(jìn)行了研究。從血吸蟲童蟲的產(chǎn)生，各種抗凍劑等條件進(jìn)行了一系列的對比研究，發(fā)現(xiàn)血吸蟲童蟲產(chǎn)生后，在60-90分鐘內(nèi)進(jìn)行低溫保存，生存率比較高。各種抗凍劑比較后發(fā)現(xiàn)，甲醇最好。蠕蟲類寄生蟲卵的低溫保存研究主要集中在圓蟲卵、雞蛔蟲卵、犬鉤蟲卵等。Cruthers16等人認(rèn)為一般采用

9、-93下保存蟲卵；沈靜德14等人采用PVP和7.5%乙二醇作為抗凍劑，采用慢速冷凍法進(jìn)行液氮保存，均獲得成功。2 寄生蟲低溫保存的主要影響因素在寄生蟲低溫研究中，原蟲和蠕蟲的低溫保存影響因素大致相同，主要是低溫抗凍劑、冷凍速度和融凍速度等，這些條件相互影響，如配合適當(dāng)，可收到較好的保存效果。21 低溫抗凍劑在蠕蟲和原蟲的低溫保存中，保護(hù)劑的選用也不盡相同。原蟲多選用甘油、DMSO、PVP等穿透性抗凍劑，如瘧原蟲寄生于紅細(xì)胞內(nèi)，應(yīng)該考慮用滲透型抗凍劑，用的較多的是甘油、DMSO和山梨醇17,18；自由生活的卡氏棘阿米巴和福氏納格里阿米巴原蟲以DMSO作為抗凍劑，冷凍保存獲得較好效果19。而在蠕蟲

10、的低溫保存中，DMSO和血清較為常用。雖然多數(shù)研究者傾向于使用低溫抗凍劑，但也有少數(shù)研究者認(rèn)為低溫抗凍劑本身屬于化學(xué)藥品，對細(xì)胞具有一定的毒性，且研究發(fā)現(xiàn)室溫下抗凍劑的毒性20和滲透性比0時大，所以應(yīng)該在冰浴下添加抗凍劑。Yuko Miyake等21人研究了DMSO、丙二醇、甘油、聚乙烯吡咯酮、血清和蛋黃的不同濃度對寄生蟲低溫保存的影響，發(fā)現(xiàn)效果最好的是甘油和DMSO，對其毒性的研究表明：DMSO的毒性最高，其次是丙二醇，最低的是血清和蛋黃?？箖鰟┑蜏厥褂没蛘吒渌镔|(zhì)共同使用，可減少毒性。有研究發(fā)現(xiàn)利用宿主的部分組織如肝脾等或宿主整體等方式來代替抗凍劑，同樣取得較好的保存效果。用動物的部分組

11、織或整個小動物來低溫保存瘧原蟲22，并對比不加抗凍劑，研究結(jié)果顯示：被感染瘧原蟲的小鼠肝臟和脾臟組織在無低溫保護(hù)劑的條件下，同樣可以進(jìn)行長期的保存和復(fù)蘇。孫榴男等23人用一定比例的DMSO和小牛血清混合液作保護(hù)劑，對凍存1-2年的馬媾疫錐蟲與傳代錐蟲的形態(tài)、致病性和藥物耐藥性等方面進(jìn)行了比較，結(jié)果基本一致，蟲體的超微結(jié)構(gòu)也無明顯差異。Bemrick24等人認(rèn)為在低溫抗凍劑中加入吐溫80或者皂土小粒，既可以增強抗凍劑的保護(hù)作用，又減輕了抗凍劑的毒性。2.2 降溫過程目前，寄生蟲的低溫保存方法有快速法和慢速法?？焖俜ㄊ侵苯拥貙?biāo)本投入到致冷劑中，它適用于少數(shù)單細(xì)胞類寄生蟲，如瘧原蟲、弓形蟲等。Wi

12、lson25等人低溫保存諾氏瘧原蟲紅內(nèi)期，研究發(fā)現(xiàn)快速冷卻更宜于保存紅細(xì)胞和瘧原蟲環(huán)形體，且能保持瘧原蟲的抗原特異性。慢速冷卻法應(yīng)用的比較廣泛，先慢速冷卻至中間的某一溫度，然后將其直接置入液氮。Ham26等人采用慢速冷卻法保存蟠尾絲蟲微絲蚴，獲得較為理想的結(jié)果。崔昱27等采用慢速冷卻法低溫保存周期型馬來絲蟲成蟲獲得成功。慢速冷卻中常因選用的寄生蟲不同中間溫度也有所不同。同一種寄生蟲，即使能同時用這兩種方法保存成功，效果也有差異。竇蘭清28等人采用快速冷卻法和慢速冷卻法來對其毛圓線蟲三期幼蟲進(jìn)行低溫保存，發(fā)現(xiàn)慢速冷卻法保存的幼蟲的存活率高。 James29等人對一些特殊品種的寄生蟲采用了玻璃化的

13、保存方法，取得了較好的保存效果。他們通過特殊的方法對溶液進(jìn)行脫水，使溶液中的低溫保護(hù)劑的濃度增加，然后快速降溫實現(xiàn)玻璃化。目前，雖然這種方法只保存了少量特殊的寄生蟲，但可以預(yù)測，玻璃化保存會被更廣泛的應(yīng)用到寄生蟲的保存中去。2.3 復(fù)溫過程與降溫過程相比，復(fù)溫過程的研究顯得薄弱得多。在許多情況下，寄生蟲在最佳冷卻速率的情況下降至低溫，然后進(jìn)行長期保存，但極有可能在復(fù)溫過程中遭受損傷而死亡。復(fù)溫過程造成損傷的原因可能有多方面。如經(jīng)冷凍后膜的滲透率發(fā)生變化?？赡茉斐蓾B透率過大或者過小，甚至沒有滲透功能。有的雖然沒有變化，但在復(fù)溫過程中產(chǎn)生細(xì)胞溶解。嚴(yán)格的講，正確的復(fù)溫過程是降溫過程的函數(shù)，應(yīng)針對不

14、同的降溫過程選用不同的復(fù)溫過程，但人們研究得還極少。Yuko Miyake21等人研究了寄生蟲的復(fù)溫過程，研究發(fā)現(xiàn)采用快速復(fù)溫能夠保持寄生蟲的較好的傳染性和能動性，雖然在實驗當(dāng)中復(fù)溫速率沒有成線性關(guān)系，但這種方法值得被采用。目前比較常用的寄生蟲復(fù)溫過程是快速解凍法解凍，整個過程控制在1分鐘之內(nèi)，即取出之后迅速浸入37-45的溫水浴中，而且溫度必須恒定，避免激烈震動，因此具體的水浴溫度因寄生蟲的種類的不同而不同。3結(jié)論與展望如何長期保存活的寄生蟲，是寄生蟲學(xué)研究的重要課題，用體外培養(yǎng)或動物接種方法保存原蟲，不僅耗時費力，還可以能導(dǎo)致蟲體存活力降低、毒力減退等生物學(xué)特性的改變，甚至出現(xiàn)才基因漂變的

15、現(xiàn)象，給寄生蟲的研究帶來一定影響。近年來，國內(nèi)外研究低溫保存技術(shù)發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)降低溫度可減緩生物新陳代謝，延長存活時間，保持原生物學(xué)特性，并在多種寄生蟲的保存試驗中得到了驗證。本文主要從寄生蟲的保存種類以及影響寄生蟲低溫保存的角度出發(fā)，綜述寄生蟲低溫保存的研究現(xiàn)狀，并進(jìn)行了比較和探討。寄生蟲的低溫保存研究主要是原蟲和蠕蟲，它們因種類及發(fā)育階段的不同所表現(xiàn)出的低溫忍耐力也不盡相同，所選用的低溫保存方法也有所不同。本文從低溫抗凍劑、降溫過程、復(fù)溫過程三個方面著手，闡述寄生蟲低溫保存的最新研究狀況，討論了不同寄生蟲低溫保存的最佳工藝，分析得出冷凍速度、融凍速度和低溫抗凍劑是影響損傷程度的主要因素。不同的

16、冷凍速度和融凍速度對寄生蟲低溫保存的存活率也不同，而且冷凍速度和融凍速度之間也相互聯(lián)系，共同影響寄生蟲低溫保存的效果，應(yīng)針對不同的降溫過程選用不同的復(fù)溫過程。曲莉30等人用3種不同方法對惡性瘧原蟲的凍存復(fù)蘇進(jìn)行了實驗比較，發(fā)現(xiàn)若冷凍速度選用不當(dāng)，在復(fù)溫過程中常出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。因為在低溫保存過程中，細(xì)胞外的水首先結(jié)冰，使未結(jié)冰溶液中的電解質(zhì)濃度升高，引起細(xì)胞溶質(zhì)損傷；此外，隨著溫度的降低，細(xì)胞內(nèi)的水分也會結(jié)冰，所形成的冰晶會進(jìn)一步破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞器，從而導(dǎo)致細(xì)胞冰晶損傷，而復(fù)溫過程可能影響膜的滲透性。另外雖然低溫抗凍劑的使用能提高寄生蟲低溫保存的存活率，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)低溫抗凍劑穿透能力的不

17、同及本身的毒性都會造成寄生蟲的損傷，所以低溫抗凍劑的選擇、使用、去除及毒性是我們急需要解決的問題。低溫生物學(xué)自上世紀(jì)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究的各個領(lǐng)域，低溫保存寄生蟲的研究取得了可喜的進(jìn)展，但對寄生蟲的冷凍保存的機制尚不十分清楚，而且寄生蟲的低溫保存主要集中在原蟲和蠕蟲方面，而且缺少對寄生蟲各個生理階段的低溫保存，所以為了建立“寄生蟲庫”，我們還有大量的工作需要做。因此，加快基礎(chǔ)研究、尋求最佳工藝、研制新型低溫設(shè)備是當(dāng)前需要重點考慮的問題。參考文獻(xiàn)1 J.H.Gill, J.M.Redwin. Cryopreservation of the first-stage larvage of trich

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