蛋白質(zhì)非共價(jià)復(fù)合物的電噴霧質(zhì)譜（esi-ms）研究

1、蛋白質(zhì)非共價(jià)復(fù)合物的電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)研究1引言本文檔由【 HYPERLINK 中文word文檔庫(kù)】 HYPERLINK 提供，轉(zhuǎn)載分發(fā)敬請(qǐng)保留本信息； HYPERLINK 中文word文檔庫(kù)免費(fèi)提供海量范文、教育、學(xué)習(xí)、政策、報(bào)告和經(jīng)濟(jì)類word文檔。word文檔細(xì)胞功能通常是由生物分子之間的弱相互作用即非共價(jià)作用而引起的，如酶與底物、蛋白質(zhì)與配體、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)及抗原抗體反應(yīng)。對(duì)這些弱相互作用的影響會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。如ras-GDP(蛋白質(zhì)-配體)，-干擾素（蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)同源二聚體），F(xiàn)KBP-rapamycin（蛋白質(zhì)-抑制劑復(fù)合物）。生物學(xué)家們對(duì)這些作用正進(jìn)行廣泛的研究以便更

2、好地了解人體是怎樣起作用的及細(xì)胞功能失常是由什么原因引起的，更重要的是如何最有效地預(yù)防這些正常過程的改變而導(dǎo)致的疾病。常規(guī)用于檢測(cè)非共價(jià)復(fù)合物的方法如凝膠色譜、超速離心、紅外光譜、差示紫外光譜、熒光光譜、園二色譜、X-晶體衍射及核磁共振等。但各有各的優(yōu)缺點(diǎn)。凝膠色譜、超速離心、紅外光譜、差示紫外光譜、熒光光譜、園二色譜等只能表明形成復(fù)合物后蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，但提供很少或不能提供關(guān)于分子量及復(fù)合物化學(xué)計(jì)量結(jié)合數(shù)的信息。X-晶體衍射和核磁共振方法被用于測(cè)定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，可以提供詳細(xì)的結(jié)構(gòu)信息。但都很費(fèi)時(shí)和復(fù)雜。X-晶體衍射只有在得到合適晶體的情況下才能應(yīng)用，但單晶的培養(yǎng)是很不容易的。核磁

3、共振分析所用樣品量很大且不能分析分子量很大的復(fù)合物（大于40KD）。隨著近年來(lái)軟電離技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)非共價(jià)復(fù)合物研究方面顯示了一定的威力。由于ESI是一項(xiàng)軟電離技術(shù)，因此很少使分子裂解產(chǎn)生碎片，因此非共價(jià)復(fù)合物能夠用ESI來(lái)研究。它能夠在非常接近天然溶液狀態(tài)的情況下研究復(fù)合物，能夠更加真實(shí)地反映生物大分子的生理狀態(tài)。到目前為止，用ESI觀察到的不同的復(fù)合物包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)（1,2），蛋白質(zhì)-配體（35），蛋白質(zhì)-寡核苷酸（6,7）和蛋白質(zhì)-雙鏈DNA（8）及蛋白質(zhì)-金屬離子復(fù)合物（911）。可見，ESI-MS已廣泛用于研究蛋白質(zhì)非共價(jià)鍵復(fù)合物。由于其具有靈敏度高、快速和質(zhì)量精確度

4、高的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合物的化學(xué)計(jì)量比能夠很容易地從分子量推導(dǎo)出。通過改變Cone電壓、改變pH值和毛細(xì)管溫度，可以比較不同化合物與蛋白質(zhì)的親合力的大小（12）。通過與部分酶解和完全酶解相結(jié)合，還可以確定小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)（13）?？傊?，應(yīng)用ESI 研究蛋白質(zhì)復(fù)合物能夠在樣品用量少（皮克摩爾到亞皮克摩爾），快速的情況下得到可靠的數(shù)據(jù)和較多的信息?；贓SI的許多優(yōu)點(diǎn)，美國(guó)一實(shí)驗(yàn)室已致力于發(fā)展質(zhì)譜方法來(lái)研究生物大分子非共價(jià)復(fù)合物，以便尋找一種抗癌劑。他們的策略是從合成的或天然的資源中篩選能夠與致病蛋白非共價(jià)鍵結(jié)合的抑制劑，以便來(lái)干預(yù)致病機(jī)理（12）。該實(shí)驗(yàn)室自1990年開始該項(xiàng)目以來(lái)，已用ESI研究

5、了ras-蛋白和其配體GDP(14)和GTP（15）的非共價(jià)相互作用。在最近的工作中，他們用ESI檢測(cè)到了ras-GDP和有機(jī)抑制劑SCH54292和SCH54341的三元復(fù)合物，在三元復(fù)合物ras-GDP-SCH54292的研究中，他們還確定了藥物和ras蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。從上述研究可以看出，ESI-MS作為研究蛋白質(zhì)非共價(jià)鍵復(fù)合物的工具，具有很好的應(yīng)用前景。2電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)的基本原理ESI是在毛細(xì)管的出口處施加一高電壓，所產(chǎn)生的高電場(chǎng)使從毛細(xì)管流出的液體霧化成細(xì)小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面積縮小，導(dǎo)致分析物以單電荷或多電荷離子的形式進(jìn)入氣相。電噴霧離子化的特點(diǎn)是產(chǎn)生多電荷

6、離子而不是碎片離子，使質(zhì)量電荷比降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀都可以檢測(cè)的范圍，因而大大擴(kuò)張了分子量的分析范圍。離子的真實(shí)分子量可以根據(jù)質(zhì)荷比及所帶電荷數(shù)計(jì)算出，一般由計(jì)算機(jī)軟件完成。電噴霧質(zhì)譜可忍受少量的鹽和緩沖液，但鹽和緩沖液的存在會(huì)使儀器的靈敏度降低。電噴霧質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn)是它可以方便地與多種分離技術(shù)聯(lián)用，如液質(zhì)聯(lián)用和毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用等。3電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)研究蛋白質(zhì)非共價(jià)復(fù)合物的實(shí)驗(yàn)條件 電噴霧質(zhì)譜研究蛋白質(zhì)非共價(jià)鍵復(fù)合物成功的關(guān)鍵條件是很好的理解和調(diào)節(jié)儀器參數(shù)和樣品制備。一般情況下用電噴霧質(zhì)譜研究蛋白質(zhì)或多肽的最靈敏和最穩(wěn)定條件并不適用于蛋白質(zhì)非共價(jià)鍵復(fù)合物的研究。通常，用電噴霧質(zhì)譜研究

7、蛋白質(zhì)時(shí)，樣品溶于含1%HCOOH 或1%HOAc的含一定比例乙腈或甲醇的水溶液中。這樣的條件對(duì)蛋白質(zhì)形成非共價(jià)鍵復(fù)合物是不利的，會(huì)破壞非共價(jià)鍵的形成。在接近生理pH時(shí)，蛋白質(zhì)保持有天然的活性構(gòu)象，才能形成非共價(jià)鍵復(fù)合物。因此，研究蛋白質(zhì)非共價(jià)鍵復(fù)合物時(shí)，樣品常溶于2-50mM NH4Oac或NH4HCO3中，pH在5-8之間比較合適。毛細(xì)管溫度或電噴霧源溫的高低對(duì)蛋白質(zhì)非共價(jià)鍵復(fù)合物也有影響。在能夠使樣品離子化的條件下，溫度越低越好。電噴霧大氣壓和真空之間的電壓或Cone電壓對(duì)復(fù)合物也有很大的影響，電壓高時(shí)會(huì)導(dǎo)致復(fù)合物的解離?？傊?，所有能夠?qū)е碌鞍踪|(zhì)變性的因素都不利于蛋白質(zhì)非共價(jià)鍵復(fù)合物的形

8、成。PH值、有機(jī)溶劑、溫度和電壓是在研究蛋白質(zhì)非共價(jià)鍵復(fù)合物時(shí)要考慮的幾個(gè)重要因素。用電噴霧質(zhì)譜研究蛋白質(zhì)非共價(jià)鍵復(fù)合物的穩(wěn)定性也常常是通過改變這幾個(gè)條件來(lái)實(shí)現(xiàn)的。4電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)在蛋白質(zhì)非共價(jià)復(fù)合物研究中的應(yīng)用事例自1991年Ganem（） 等最早應(yīng)用電噴霧質(zhì)譜研究蛋白質(zhì)FKBP12 和其配體FK506 和rapamycin 的非共價(jià)鍵復(fù)合物以來(lái)，該技術(shù)就被越來(lái)越多的學(xué)者所應(yīng)用。Smith 和Zhang（）、Loo()及Pramnik等（）相繼發(fā)表了很好有不同側(cè)重點(diǎn)的綜述。本人僅舉幾個(gè)典型事例來(lái)說明電噴霧質(zhì)譜在蛋白質(zhì)非共價(jià)鍵復(fù)合物中的廣泛應(yīng)用及其優(yōu)越性。A. 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作

9、用電噴霧質(zhì)譜在研究蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)方面顯示出了巨大的能力。蛋白質(zhì)復(fù)合物有同源和異源兩種。質(zhì)譜根據(jù)質(zhì)量的差別可以區(qū)分這兩種復(fù)合物。Brookhaven protein databank Brookhaven 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的所有蛋白質(zhì)中，33%的形成了多聚體復(fù)合物（a1）。在這些復(fù)合物中，80%的形成了二聚體或四聚體。電噴霧質(zhì)譜非常適用于鑒定蛋白質(zhì)的亞基數(shù)目。Loo(a2)等報(bào)道了HIV整合酶突變體IN F185K同源二聚體的電噴霧質(zhì)譜研究。HIV整合酶在HIV病毒復(fù)制過程中起非常重要的作用，有可能成為一個(gè)新的抗愛滋病藥物的靶點(diǎn)(a3)。由于HIV整合酶的溶解度很小，因此不易搞清它的構(gòu)象。IN F1

10、85K是它的一個(gè)突變體，溶解度增大，但不影響其活性。研究表明，HIV整合酶以二聚體的形式起作用，與晶體結(jié)構(gòu)是一致的（a4-6）。在pH2.5的溶液中（乙腈：水=2:1v/v, 含3%乙酸），IN F185KIN F185K的電噴霧質(zhì)譜圖是單體的多電荷峰，所帶電荷從+12到+22，共11個(gè)多電荷峰。轉(zhuǎn)換后的分子量為18172.0。在酸性及有有機(jī)溶劑乙腈存在的條件下，IN F185K徹底變性，使蛋白中所有緘性氨基酸都暴露出來(lái)帶上質(zhì)子，因此形成了最高帶+22個(gè)電荷的11個(gè)多電荷峰。在pH6.5的10mM的乙酸氨溶液中，IN F185K的電噴霧質(zhì)譜圖是二聚體的多電荷峰，在m/z3000左右形成了三個(gè)多

11、電荷峰，最高所帶電荷為+13。轉(zhuǎn)換后的分子量為36345.9。在pH6.5的10mM的乙酸氨溶液中，IN F185K保持有天然的活性構(gòu)象，形成結(jié)構(gòu)緊密的二聚體，只有暴露在分子表面的部分緘性氨基酸才能夠帶上質(zhì)子，因此僅有三個(gè)多電荷峰。增加IN F185K的濃度，并沒有觀察到其它非特異性的多聚體。將大氣壓和真空接口的電壓從50 增加到140，二聚體則降解為單體。B. 蛋白質(zhì)和配體Schwartz(b1)等用電噴霧質(zhì)譜研究了兩個(gè)小分子配體生物素（分子量244）和亞氨基生物素（分子量243）和一個(gè)由四個(gè)亞基組成的大蛋白鏈親和素核心core streptavidin （分子量53084）的非共價(jià)鍵結(jié)合行

12、為。鏈親和素Streptavidin 和親和素一樣，與生物素由很特異、很強(qiáng)的親和力（Kd=10-15M）,這使得這一類非共價(jià)鍵復(fù)合物在生物化學(xué)和分子生物學(xué)，尤其是免疫化學(xué)和親和分離中的應(yīng)用非常的廣泛（b2-5）。而和亞胺生物素的親和力很弱（Kd=10-7M）。將配體和鏈親和素核心溶解于pH8.6 10mM的乙酸氨溶液中，配體和蛋白 鏈親和素核心core streptavidin的摩爾濃度比為7:1。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜分析，結(jié)果表明，與已知的溶液中的結(jié)果一致，生物素和鏈親和素核心四聚體形成了4:1的非共價(jià)鍵復(fù)合物，而亞胺生物素和鏈親和素核心沒有形成復(fù)合物。只有在儀器界面條件極為溫和

13、，配體濃度更高和孵育時(shí)間更長(zhǎng)時(shí)才有部分亞胺生物素和鏈親和素核心結(jié)合，但結(jié)合并不完全。作者用熱誘導(dǎo)裂解還研究了配體和鏈親和素核心非共價(jià)鍵復(fù)合物的穩(wěn)定性，毛細(xì)管溫度升高時(shí)，復(fù)合物裂解，部分蛋白質(zhì)四聚體也解離為單體。作者還用負(fù)離子電噴霧質(zhì)譜研究了生物素化的寡核苷酸和鏈親和素核心的非共價(jià)鍵結(jié)合。與溶液中的行為一致，寡核苷酸和鏈親和素核心化學(xué)結(jié)合計(jì)量比為4:1。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用電噴霧質(zhì)譜研究大分子蛋白和小分子配體相互作用的結(jié)果和溶液中的行為是一致的，且靈敏、準(zhǔn)確、快速，有很好的應(yīng)用前景。 C. 酶和抑制劑 HIV-1蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶家族的一個(gè)成員。該家族成員包括木瓜酶、腎素、凝乳酶及組織蛋白酶D

14、等(c1)。HIV蛋白酶專一性地催化病毒 gag和gag-pol轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，產(chǎn)生裝配病毒顆粒所需要的酶和結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。HIV-1蛋白酶活性在pH6時(shí)最高，將二聚體解離會(huì)導(dǎo)致酶活性的完全散失。胃蛋白酶抑制劑A（ isovaleryl-Val-Val-Sta-Ala-Sta, Mr686）是天冬氨酸蛋白酶的特異性抑制劑(c2-3)。HIV-1蛋白酶的活性位點(diǎn)有兩個(gè)亞基的相同部分組成。抑制劑和酶的反應(yīng)有氫鍵和疏水作用共同起作用。Loo(a2)等用電噴霧質(zhì)譜研究了胃蛋白酶抑制劑A和HIV-1蛋白酶的結(jié)合與pH值的關(guān)系。在pH2.5的2.5% 乙酸溶液（乙腈：水=2：1）中，只有HIV-1蛋白酶單體的多電荷

15、峰。最高所帶電荷數(shù)為13，共6個(gè)多電荷峰。將胃蛋白酶抑制劑A和HIV-1蛋白酶的乙酸氨儲(chǔ)備液混合后，用乙酸或氨水調(diào)節(jié)溶液的pH值并測(cè)定其電噴霧質(zhì)譜圖。在pH4.7-6.9的溶液中觀察到了胃蛋白酶抑制劑A和HIV-1蛋白酶二聚體的三元復(fù)合物，同時(shí)有HIV-1蛋白酶二聚體和單體的存在。酶與抑制劑的三元復(fù)合物在 pH5.5-6.0時(shí)最穩(wěn)定。該結(jié)果與以前Baca and Kent(c4) 報(bào)道的結(jié)果一致。酶與抑制劑的三元復(fù)合物對(duì)電噴霧質(zhì)譜的大氣壓真空接口條件很敏感，在低的 Vts(10V)和低毛細(xì)管溫度時(shí)（175）三元復(fù)合物的豐度最高。提高毛細(xì)管溫度會(huì)使三元復(fù)合物降解。D. 抗原-抗體反應(yīng)用電噴霧質(zhì)譜

16、研究抗原抗體相互作用不僅靈敏、準(zhǔn)確、快速，與酶解相結(jié)合還可以確定抗原表位及抗體互補(bǔ)位。MILLAR(d1) 等用電噴霧質(zhì)譜直接檢測(cè)到了一個(gè)新的能夠抑制HIV-I活性的有17個(gè)氨基酸組成的微抗體（ MicroAb）和代表從巴西（clade B）和非洲(clade A)分離出的第一代 HIV-1菌株V3區(qū)的肽(V3肽)的相互作用。該微抗體（ MicroAb）是一個(gè)能特異性地與HIV-1包膜糖蛋白gp120V3 環(huán)狀區(qū)作用的鼠單抗IGGI(F58)的重鏈第三補(bǔ)體區(qū)（CDR-H3）的一部分(d2)。它的活性比F58的高5倍。將MicroAb和V3肽溶解于pH7.0的50mM的乙酸氨溶液中，使?jié)舛确謩e為

17、500ug/ml，37反應(yīng)1小時(shí)后進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜測(cè)定。觀察到了MicroAb和V3肽的復(fù)合物。但同時(shí)存在未結(jié)合MicroAb和V3肽，且復(fù)合物的豐度相對(duì)較低?？赡苁撬玫妮d液（乙腈：水=1：1，含0.1%甲酸）不大合適，不利于復(fù)合物的形成。結(jié)果表明MicroAb是通過與病毒顆粒直接結(jié)合而介導(dǎo)病毒失活的。將V3肽用胰蛋白酶進(jìn)行完全酶解（37 1小時(shí)）和部分酶解（4 2分鐘）。然后將酶解肽段和MicroAb混合后在37反應(yīng)1小時(shí)后進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜測(cè)定。結(jié)果表明只有部分肽段與MicroAb結(jié)合。通過比較與MicroAb結(jié)合肽段的序列及進(jìn)一步研究，證明MicroAb的抗原表位是RKSIXIGPGR。該實(shí)

18、驗(yàn)結(jié)果說明用電噴霧質(zhì)譜研究溶液中抗原-抗體反應(yīng)是靈敏、快速、準(zhǔn)確的方法。E. 蛋白質(zhì)和寡核苷酸蛋白質(zhì)和DNA的相互作用涉及到細(xì)胞過程的許多方面，因此具有重要的意義?；瘜W(xué)結(jié)合計(jì)量是蛋白質(zhì)和DNA相互作用的一個(gè)重要特性。當(dāng)一個(gè)樣品中含有不同的化學(xué)結(jié)合計(jì)量數(shù)或結(jié)合后分子量差別很小時(shí)，化學(xué)結(jié)合計(jì)量的測(cè)定就更為困難(e1)。電噴霧質(zhì)譜由于具有高靈敏度和高質(zhì)量準(zhǔn)確度的優(yōu)點(diǎn)，因此可以很準(zhǔn)確的測(cè)定其化學(xué)結(jié)合計(jì)量。Cheng(e2)等用電噴霧質(zhì)譜研究了從細(xì)菌噬菌體分離的geneV蛋白和幾個(gè)寡核苷酸的化學(xué)結(jié)合計(jì)量數(shù)。在噬菌體的復(fù)制過程中Gene V 蛋白起穩(wěn)定單鏈DNA(ssDNA)的作用，并將合成的噬菌體DNA

19、從雙鏈轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂湣Ｒ阎猤eneV蛋白在生理?xiàng)l件下主要以二聚體存在，Kd-12 M。在pH7.0 10mM乙酸氨溶液中，無(wú)論是正離子還是負(fù)離子電噴霧質(zhì)譜，geneV蛋白都主要以二聚體存在。在負(fù)離子條件下，形成了最高所帶電荷為-8的四個(gè)多電荷峰。在pH3.0 50mM乙酸溶液中，形成了最高帶+14電荷的11個(gè)多電荷峰。這與酸致蛋白質(zhì)變性的結(jié)果一致。將不同濃度比的geneV蛋白和16mer的寡核苷酸在pH7.0 10-50mM的乙酸氨中反應(yīng)10分鐘后進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜分析，結(jié)果表明gene V蛋白和16mer 寡核苷酸可以形成不同化學(xué)結(jié)合計(jì)量的非共價(jià)鍵復(fù)合物。主要是4:1(gene V :16mer I

20、), 當(dāng)寡核苷酸過量時(shí)，有少量2:1的復(fù)合物存在。作者同時(shí)用電噴霧質(zhì)譜研究了gene V蛋白和 d (pT)13 、d (pT)15、 d (pT)18三個(gè)同源寡核苷酸的化學(xué)計(jì)量結(jié)合數(shù)。當(dāng)gene V蛋白的摩爾濃度和 d (pT)13 、d (pT)15、 d (pT)18混合物的總摩爾濃度比為1:1 時(shí)， d (pT)18 主要形成4:1的復(fù)合物，而d (pT)13 和d (pT)15主要形成2:1的復(fù)合物。當(dāng)gene V蛋白的摩爾濃度和 d (pT)13 、d (pT)15、 d (pT)18混合物的總摩爾濃度比為2:1時(shí)，d (pT)18 和d (pT)15形成4:1的復(fù)合物，而d (p

21、T)13仍形成2:1的復(fù)合物。說明gene V蛋白和d (pT)13的主要化學(xué)結(jié)合計(jì)量數(shù)為2:1，和d (pT)18的為4:1,而和d (pT)15的化學(xué)結(jié)合計(jì)量數(shù)則根據(jù)寡核苷酸和gene V蛋白的相對(duì)濃度不同為4:1或2:1。有文獻(xiàn)報(bào)道gene V蛋白與poly(dA)和poly(dT)的親和力相差兩個(gè)數(shù)量級(jí)。作者用電噴霧質(zhì)譜也得到了相同的結(jié)論。將gene V蛋白和d (pT)13 、d (pA)14的混合物在pH 7.0 10mM乙酸氨溶液中進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜分析。當(dāng)d (pT)13和d (pA)14摩爾濃度相同時(shí)，主要是gene V蛋白和d (pT)13 形成的2:1的非共價(jià)鍵復(fù)合物。幾乎沒

22、有g(shù)ene V蛋白和d (pA)14形成的復(fù)合物。當(dāng)只有d (pA)14 時(shí)，gene V蛋白和d (pA)14可以很容易形成2:1的復(fù)合物。當(dāng)d (pT)13和d (pA)14摩爾濃度為2:100時(shí)，gene V蛋白和d (pT)13 形成的2:1復(fù)合物的豐度是gene V蛋白和d (pA)14形成的2:1復(fù)合物的8倍。和濃度一起考慮，則gene V蛋白和d (pT)13的親和力是和d (pA)14親和力的400倍?？梢?，電噴霧質(zhì)譜在研究蛋白質(zhì)和DNA 相互作用時(shí)有巨大的優(yōu)越性。F. 金屬離子和肽金屬離子在許多生物過程都起著非常重要的作用。它們通過觸發(fā)機(jī)理、穩(wěn)定結(jié)構(gòu)及控制氧化還原反應(yīng)來(lái)起作用

23、。在所有的二價(jià)金屬離子中，鈣離子的作用最為重要。借助于細(xì)胞膜內(nèi)外的濃度差，鈣離子在調(diào)節(jié)細(xì)胞過程中常充當(dāng)?shù)诙攀沟淖饔?。其調(diào)節(jié)細(xì)胞的過程常涉及鈣結(jié)合蛋白質(zhì)（f1-5）。Veenstra(f6)等用電噴霧質(zhì)譜研究了鈣調(diào)蛋白和兩個(gè)肽的非共價(jià)鍵復(fù)合物。一個(gè)肽是鈣調(diào)素依賴的蛋白酶II的鈣調(diào)素結(jié)合區(qū)，一個(gè)是毒蜂肽。只有在鈣離子存在時(shí)，鈣調(diào)素和兩個(gè)肽及鈣離子形成1:1:4(鈣調(diào)素：肽：鈣離子)的三元復(fù)合物。同時(shí)他們還證明三元復(fù)合物的穩(wěn)定性與電噴霧質(zhì)譜的源溫有關(guān)。 Nemirovskiy (f7)等用串聯(lián)質(zhì)譜（FAB和ESI）研究了以兔肌鈣蛋白的鈣離子結(jié)合位元點(diǎn)III為模型的一系列小肽和鈣離子復(fù)合物的高能和低

24、能碰撞活化裂解行為。電噴霧質(zhì)譜中產(chǎn)生的鈣離子/肽段碎片有鈣離子結(jié)合控制，提供了鈣離子結(jié)合位點(diǎn)的信息。表明鈣離子結(jié)合位點(diǎn)涉及到一個(gè)天冬氨酸、一個(gè)谷氨酸和一個(gè)谷氨酰氨?？煸愚Z擊質(zhì)譜中產(chǎn)生的肽段十分復(fù)雜，不易解析。Hu and Loo(f8)用電噴霧質(zhì)譜研究了小白蛋白和鈣調(diào)素與鈣離子的化學(xué)結(jié)合計(jì)量數(shù)及其協(xié)同關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)小白蛋白的兩個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)與鈣離子的結(jié)合有很強(qiáng)的協(xié)同性。在鈣離子濃度高時(shí)，鈣調(diào)素可以和四個(gè)鈣離子結(jié)合。第三個(gè)鈣離子和第四個(gè)鈣離子與鈣調(diào)素的結(jié)合有很強(qiáng)的協(xié)同性。鈣調(diào)素分子中與鈣離子結(jié)合的兩部分也有很強(qiáng)的相互作用。5結(jié)論參考文獻(xiàn)：Ogorzalekloo, R. R.; Goodle

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