蛋白質(zhì)含量測定法Bradford法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程SOP

1、蛋白質(zhì)含量測定法（Bradford法）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程類別工作標(biāo)準(zhǔn)文件文件編號XXXXXX 版本號 V01貝碼共 頁執(zhí)行日期年 月曰（禁止復(fù)印）審批頁一起草人審核人批準(zhǔn)人部門分析研究部分析研究部CTO姓名李曉鵬簽名日期年 月曰年 月曰年 月曰第1頁/共6頁文件變更歷史版本號執(zhí)行日期變更原因、依據(jù)及變更內(nèi)容V002019年10月18日新文件體系的新文件第2頁/共6頁 TOC o 1-5 h z 1目的42范圍43定義44環(huán)境、健康和安全 45培訓(xùn)46職責(zé)47程序(內(nèi)容)4原理4實驗材料4操作步驟5結(jié)果計算5判定標(biāo)準(zhǔn)6注意事項68相關(guān)文件69參考文獻(xiàn)610流程圖611 附錄6 HYPERLINK l

2、bookmark0 o Current Document 蛋白質(zhì)含量(Bradford法)測定記錄1蛋白質(zhì)含量(Bradford法)測定記錄(適用于多個樣品)1第3頁/共6頁1目的規(guī)范蛋白質(zhì)含量檢測（Bradford法）的操作過程。2范圍本規(guī)程適用于樣品中蛋白質(zhì)含量的檢測（Bradford法）3定義4環(huán)境、健康和安全5培訓(xùn)培訓(xùn)部門：分析研究部。培訓(xùn)對象：分析研究部相關(guān)人員。培訓(xùn)方式和時數(shù)：自學(xué)，1小時?？己朔绞剑簡柎?。6職責(zé)質(zhì)量保證部：負(fù)責(zé)監(jiān)督本文件的執(zhí)行。分析研究部：負(fù)責(zé)嚴(yán)格執(zhí)行本規(guī)程規(guī)定。7程序（內(nèi)容）原理本法系依據(jù)在酸性溶液中考馬斯亮藍(lán) G250與蛋白質(zhì)分子中的堿性氨基酸（精 氨酸）和芳

3、香族氨基酸結(jié)合形成藍(lán)色復(fù)合物，該藍(lán)色復(fù)合物在595nm處有最大吸收值，在一定濃度范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，以蛋白質(zhì)對照品溶液 作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用比色法測定供試品中蛋白質(zhì)的含量。實驗材料試藥與試液超純水：電阻率不低于18.2MQ - cm本方法所有試液均用超純水配制。酸性染色液：（1）自配：稱取0.l0g考馬斯亮藍(lán)G250,加乙醇50ml溶解后，加磷酸100ml, 加水稀釋至1000ml,混勻。濾過，取濾液，即得。本試劑置棕色瓶內(nèi)避光保存， 如有沉淀產(chǎn)生，使用前再濾過，28 c保存6個月。第4頁/共6頁（2）購買商品化試劑：如 Quick StartTM Bradford 1X Dye

4、Reagent, Cat#500- 0205,廠家BIO-RAD。商品化試劑均根據(jù)產(chǎn)品說明書使用。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)BSA對照品溶液：取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（來源：購自中國食品藥品檢定研 究院），按標(biāo)示含量加水溶解并制成適宜濃度（建議配制為1.02.0mg/ml）。分裝后于-20C及以下溫度保存，有效期 2年。儀器與用具移液器、具塞玻璃試管、玻璃比色皿、紫外-可見分光光度計、EP管、漩渦 混合儀。操作步驟標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取BSA對照品溶液，用水稀釋至0.10mg/ml。按下表稀釋方 法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。BSA對照品溶液均直接稀釋至具塞試管內(nèi)。表7.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制作表管號0號1號2號3號4號5號BSA對照品濃度（叱

5、g/n）l0.0010.0020.0040.0060.0080.00BSA對照品體積（小l）0100200400600800稀釋用水體積（口1000900800600400200供試品稀釋：按預(yù)估濃度將供試品稀釋至終濃度在20 g g/ml 60 pg/m問,單次稀釋的最高稀釋倍數(shù)不超過12倍，稀釋時取樣體積不能低于 50 口每個樣 品各做一個平行樣。分別量取1.0ml樣品加入具塞試管內(nèi)或者最后一步稀釋時直 接稀釋至具塞試管內(nèi)。若供試品緩沖液較為復(fù)雜（如有些工藝中間樣品變性液和復(fù)性蛋白液中含有 尿素），需設(shè)立空白緩沖液對照，進(jìn)行供試品吸光度的校正，詳見各品種項下規(guī) 定，檢測時其終稀釋倍數(shù)與對應(yīng)

6、供試品相同。分別向各試管中加入已平衡至室溫的酸性染色液5.0ml,立即混勻，室溫下放置10min。在紫外-可見分光光度計中，在595nm波長處，以0號管作為空白，分別檢 測1號至5號對照品管和各樣品管的吸光值。結(jié)果計算第5頁/共6頁以對照品溶液OD值為縱坐標(biāo)、對照品溶液的含量為橫坐標(biāo)做線性回歸， 求得 回歸方程和線性相關(guān)系數(shù) R2。然后將供試品溶液的OD值（如進(jìn)行了校正，則用 校正后OD值）代入線性回歸方程，計算供試品溶液的蛋白質(zhì)含量實測值，并乘以其稀釋倍數(shù)即得供試品溶液的蛋白質(zhì)含量。判定標(biāo)準(zhǔn)實驗成立標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù) R2 0.99,平行樣實測值之間的相 對偏差0 2.0%。若同時

7、滿足以上兩個條件則本次實驗有效，否則實驗無效。注意事項堿性較強(qiáng)的供試品應(yīng)將pH調(diào)到中性后再進(jìn)行測定。含有去污劑、Triton x-100、吐溫、十二烷基硫酸鈉（SDS）等的供試品不能 采用該法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定。本法測定時不能使用可與染色物結(jié)合的比色皿（如石英比色皿），建議使用 玻璃比色皿或其他適宜材料的比色皿。向各試管中分別加入酸性染色液時，應(yīng)合理安排好管與管的間隔時間，控制 好每管樣品的反應(yīng)時間，使反應(yīng)時間盡可能保持一致。注：本法通?？蓽y定1200的蛋白質(zhì)量，依據(jù)實際情況（如不同品牌染 液、環(huán)境溫度等因素），對照品溶液取用量可在該測定范圍內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。8相關(guān)文件9參考文獻(xiàn)9.1中國藥典2

8、015年版第四部，通則0731, “蛋白質(zhì)含量測定法 第五法-考 馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）”。10流程圖11附錄第6頁/共6頁蛋白質(zhì)含量（Bradford法）測定記錄品 名批號/編號規(guī) 格開檢日期年 月日檢驗依據(jù)，、實驗材料1、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)名稱濃度編號BSA對照品溶液2、試藥與試液名 稱批號/編號（來源）稀釋液（)口自配考馬斯亮藍(lán)（G-250）染液口 Quick Start Reagent口Bradford 1X Dye3、儀器與用具名稱生產(chǎn)廠家/型號設(shè)備編號紫外-可見分 光光度計 Thermo/ Evolution 201口其他比色皿 3.5ml玻璃比色皿口其他二、操作步驟1、樣品處理標(biāo)

9、準(zhǔn)曲線：取BSA對照品溶液（濃度 mg/ml）,用水稀釋至0.10mg/ml, 稀釋過程為： 按下表稀釋方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對照品溶液均直接稀釋至具塞玻璃試管內(nèi)。第1頁/共3頁管號0號1號2號3號4號5號BSA對照品濃度（叱g/n）l0.0010.0020.0040.0060.0080.00BSA對照品體積（小l）0100200400600800稀釋用水體積（1）11000900800600400200供試品稀釋處理口原液：取供試品 瓶/支，預(yù)估蛋白質(zhì)濃度為 mg/ml口成品：取供試品 一瓶/支，分別用ml水復(fù)溶，初始蛋白質(zhì)濃度為mg/ml。1.2.2用稀釋液按下表稀釋方法稀釋待測樣品，并設(shè)置平

10、行樣稀釋步驟取樣體積（）1稀釋液體積（）1本步稀釋 倍數(shù)（倍）總稀釋 倍數(shù)（倍）步驟1步驟2步驟3預(yù)估蛋白質(zhì)終濃 度（g/ml2、分別取稀釋后待測樣品溶液各1.0ml置具塞試管內(nèi)（或最后一步稀釋直接稀 釋至試管內(nèi)），并做好標(biāo)記。3、分別向各管中加入 ml已平衡至室溫的考馬斯亮藍(lán)（G-250）染液，于 室溫下放置 min后，以0號管作為空白，分別于595nm波長處測定吸光度。I、結(jié)果計算1、以BSA對照品濃度為X軸，其對應(yīng)的OD值為Y軸，做直線回歸。對照品濃度（11 g/m）OD值直線回歸方程為： ,線性相關(guān)系數(shù)R2為2、將測得的樣品OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出實測值，并按以下公式計算供試品 蛋白質(zhì)

11、含量。蛋白質(zhì)含量（mg/ml）=實測值平均值（以g/m）l麻釋倍數(shù)+1000蛋白質(zhì)含量（mg/瓶）=實測值平均值（g/mj淅釋倍數(shù)液溶體積+1000第2頁/共3頁樣品稀釋 倍數(shù)實測值(a g/mJ實測值相對 偏差（）實測值平均值（g g/ml蛋白質(zhì)含量（mg/ml）平行樣1平行樣2原液：蛋白質(zhì)含量為 mg/ml口成品：蛋白質(zhì)含量為標(biāo)示量百分比二蛋白質(zhì)含量（） X復(fù)溶體積（）位白質(zhì)含量標(biāo)示量（ ） x 100%=%3、本次實驗線性相關(guān)系數(shù) R2= （D0.99 D0.99）;實測值相對偏差為 （2.0%）,則本次實驗結(jié)果（有效口無效）。四、結(jié)果判定1、標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：口 N/A2、檢驗結(jié)果：3、檢驗結(jié)

12、論： 符合規(guī)定不符合規(guī)定口復(fù)檢 口 N/A五、備注1、附原始檢測數(shù)據(jù)共 頁。2、 以下無內(nèi)容操作人/日期： 復(fù)核人/日期：第3頁/共3頁蛋白質(zhì)含量（Bradford法）測定記錄（適用于多個樣品）品 名批號/編號規(guī) 格開檢日期年 月日檢驗依據(jù)，、實驗材料1、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)名 稱濃度編號BSA對照品溶液2、試藥與試液名 稱批號/編號（來源）稀釋液（）考馬斯鳧然（G-250）染液口自配口 Quick StartTM Bradford 1X DyeReagent3、儀器與用具名稱生產(chǎn)廠家/型號設(shè)備編號紫外-可見分 光光度計 Thermo/ Evolution 201口其他比色皿 3.5ml玻璃比色皿口其他操

13、作步驟1、樣品處理標(biāo)準(zhǔn)曲線：取BSA對照品溶液（濃度 mg/ml）,用水稀釋至0.10mg/ml, 稀釋過程為： 按下表稀釋方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對照品溶液均直接稀釋至具塞玻璃試管內(nèi)。第1頁/共4頁管號0號1號2號3號4號5號BSA對照品濃度（叱g/n）l0.0010.0020.0040.0060.0080.00BSA對照品體積（小1）0100200400600800稀釋用水體積（1）11000900800600400200供試品稀釋處理：供試品前處理：用稀釋液按下表稀釋方法稀釋待測樣品，并設(shè)置平行樣。樣品批號/編 號預(yù)估蛋白 質(zhì)濃度 （mg/ml）稀釋 步驟取樣體 積（稀釋液 體積 （樣品稀釋倍

14、數(shù)預(yù)估蛋白 質(zhì)終濃度（g g/m）本步稀 釋倍數(shù)總稀釋 倍數(shù)步驟1步驟2步驟3步驟1步驟2步驟3步驟1步驟2步驟3步驟1步驟2步驟3步驟1步驟2步驟3步驟1步驟2步驟3第2頁/共4頁2、分別取稀釋后待測樣品溶液各1.0ml置具塞試管內(nèi)（或最后一步稀釋直接稀釋至試管內(nèi)），并做好標(biāo)記3、分別向各管中加入 ml已平衡至室溫的考馬斯亮藍(lán)（G-250）染液，于 室溫下放置 min后，以0號管作為空白，分別于595nm波長處測定吸光度。、結(jié)果計算1、以BSA對照品濃度為橫坐標(biāo)（X軸），其對應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo)（Y軸）, 做直線回歸。獲得直線回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)R2。對照品濃度（pg/m）OD值直線回歸方程

15、為： ,線性相關(guān)系數(shù)R2為2、將測得的樣品OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出實測值，并按以下公式計算供試品 蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)含量（mg/ml）=實測值平均值（仙g/m）l釋倍數(shù)+1000口蛋白質(zhì)含量（mg/瓶）=實測值平均值（g g/m）l釋倍數(shù)4溶體積+1000口蛋白質(zhì)含量占標(biāo)示量的百分比二蛋白質(zhì)含量 也白質(zhì)含量標(biāo)示量x 100%樣品批號/編號稀釋 倍數(shù)實測值(g g/ml實測值的 相對偏差 （%）實測值 平均值（g g/mj蛋白質(zhì)含量（mg/）成品復(fù)溶體積（ml/瓶）占林小里（）的百分比（%）第3頁/共4頁3、本次實驗線性相關(guān)系數(shù) R2= （D0.99 口0.99）;實測值相對偏差為 （口均0 2.