動(dòng)物免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-免疫電鏡技術(shù)

1、PAGE PAGE 7 第十四章 免疫電鏡技術(shù)(Immune electron microscopy technique)一、概 述原理 免疫電鏡技術(shù)是免疫化學(xué)技術(shù)與電鏡技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，是在超微結(jié)構(gòu)水平研究和觀察抗原、抗體結(jié)合定位的一種方法學(xué)。它主要分為兩大類：一類是免疫凝集電鏡技術(shù)，即采用抗原抗體凝集反應(yīng)后，再經(jīng)負(fù)染色直接在電鏡下觀察；另一類則是免疫電鏡定位技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)是利用帶有特殊標(biāo)記的抗體與相應(yīng)抗原相結(jié)合，在電子顯微鏡下觀察，由于標(biāo)準(zhǔn)物形成一定的電子密度而指示出相應(yīng)抗原所在的部位。免疫電鏡的應(yīng)用，使得抗原和抗體定位的研究進(jìn)入到亞細(xì)胞的水平。（二）影響免疫電鏡的一些因素1標(biāo)記物 用于電鏡

2、觀察的標(biāo)記物有三類：一類是電子密度致密的標(biāo)記物，如鐵蛋白、辣根過氧化物酶等。另一類則是放射性同位素，如135I、35S、32P、14C、3H等，第三類則是有獨(dú)特形狀的標(biāo)記物，如血蘭蛋白、噬菌體等。對(duì)標(biāo)記物的要求是：具有特定的形狀、不影響抗原抗體復(fù)合物的特性與形狀。目前用于免疫電鏡的標(biāo)記物主要是鐵蛋白和HRP。兩者各有其優(yōu)點(diǎn)，鐵蛋白電子密度致密。觀察時(shí)反差大，優(yōu)于酶標(biāo)記，但鐵蛋白分子量大(460 000)，穿透能力差，所以適于細(xì)胞表面抗原的定位，另外鐵蛋白的標(biāo)記過程比較復(fù)雜。HRP分子量小(40 000)，穿透力強(qiáng)，有利于標(biāo)記抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，適于細(xì)胞內(nèi)的抗原定位。2固定劑 固定是免疫電鏡較關(guān)鍵的

3、一步，免疫電鏡中的固定與一般超薄切片中的固定的不同之點(diǎn)在于既考慮保存細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),又要考慮到抗原的失活性問題。固定劑的要求：不損害細(xì)胞內(nèi)抗原的活性；固定速度快、效果好；分子量小，易于滲透；固定后,不引起交聯(lián)，造成空間的阻礙，影響標(biāo)記抗體進(jìn)入抗原位。影響固定的因素有：采用固定劑的種類；固定劑的濃度，濃度過大，對(duì)抗原的活性有影響，濃度過小，固定效果差；固定劑的pH；固定劑的溫度,一般采用24冷固定；這樣能降低細(xì)胞的自浴作用和水分的抽提；固定時(shí)間與溫度有關(guān)，溫度高，固定快，也與緩沖系的離子強(qiáng)度有關(guān)，離子強(qiáng)度大，滲透壓大，穿透力強(qiáng)，固定要快。不同的固定劑，或同一固定劑的不同濃度所需的固定時(shí)間也不一致

4、；與被固定的細(xì)胞類型有關(guān)。目前常用的固定系統(tǒng)有：4%聚甲醛，1.5%2%戊二醛，1%多聚甲醛1%戊二醛，4%多聚甲醛0.5%苦味酸0.25%戊二醛，96%乙醇1%醋酸。不論采用哪些系統(tǒng)，使用前必須用已知效價(jià)的抗原做一系列預(yù)實(shí)驗(yàn)。如固定劑的種類濃度、溫度、pH及固定時(shí)間等。然后做出預(yù)處理的效價(jià)，作為失活參考以再選擇最適條件。3非特異性吸附 非特異性吸附與酶標(biāo)抗體、抗血清的稀釋度、染色時(shí)間，溫度及介質(zhì)等有關(guān)，其中最主要的是抗血清及標(biāo)記抗體的稀釋。一般認(rèn)為高效價(jià)抗血清或標(biāo)記抗體稀釋到低蛋白濃度，用于標(biāo)記染色可獲得最理想的結(jié)果。因?yàn)榈偷鞍诐舛扔欣诮档头翘禺愋晕?。?shí)際應(yīng)用的蛋白濃度大致在0.50mg

5、/ml2mg/ml。工作效價(jià)一般在1201400,在實(shí)際工作中，將標(biāo)記抗體或抗血清稀釋到1100倍以上則可獲得理想的陽性結(jié)果，而非特異性吸附必然降得很低。工作濃度的選擇是將標(biāo)記抗體或抗血清作12、14、181256的稀釋，做已知陽性標(biāo)本的標(biāo)記染色觀察，取其陽性沉積物明顯，而非特異性吸附最低的一稀釋度做為工作濃度。4標(biāo)記染色法 標(biāo)記染色法分為直接染色法與間接染色法兩種。前者的特點(diǎn)是特異性較高,敏感性低，標(biāo)記抗體只能用于檢測(cè)一種抗原。后者敏感性較強(qiáng)，一種標(biāo)記抗體可用于多種抗原的檢測(cè)。缺點(diǎn)是特異性較差。二、酶免疫電鏡技術(shù)原理 酶免疫電鏡技術(shù)是利用酶的高效率的催化作用對(duì)其底物的反應(yīng)形成不同的電子密度，

6、借助于電子顯微鏡觀察，證明酶的存在，從而對(duì)抗原進(jìn)行定位。（二）材料與試劑1PBS液 取NaCl 8.5g，Na2HPO40.85g，KH2PO40.54g，加水至1 000ml即可。2DAB溶液 取5mgDAB(3、3二氨基聯(lián)苯胺)加入10mlTrisHCl緩沖液(0.05mMol/L pH 7.6)，加1%H2O20.5ml1ml。配制時(shí)，避光進(jìn)行，現(xiàn)用現(xiàn)配。在顯色完成沖洗過程中，要保持流水沖洗，防止非特異性物質(zhì)積于標(biāo)本上。3戊二醛固定液 取50ml 0.2Mol/L PBS緩沖液與25%戊二醛按以下比例配制：0.2Mol/LPBS液 50 50 50 50 50 25%戊二醛（ml） 4

7、6 8 10 12重蒸餾水（ml） 46 44 42 40 28固定液終濃度（%） 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0（三）操作方法1酶標(biāo)抗體的制備 疫酶技術(shù)章。2取材 將培養(yǎng)細(xì)胞或懸浮細(xì)胞用0.1Mol/L PBS液沖洗，離心沉淀后，立即轉(zhuǎn)入固定液(2%甲醛液或2%戊二醛液均可)pH 7.2，4固定5min30min(依抗原性質(zhì)所定)。如病料為組織塊，則取適當(dāng)大小，先固定1h然后取出，以新的雙面刀片切成50100m的薄組織再行固定1h2h。3漂洗 以PBS液漂洗過夜，換液34次。4血清孵育，251h或4過夜，孵育的標(biāo)本放置于加蓋的瓷盤內(nèi)，底層墊數(shù)層紗布。防止抗血清干燥凝固，不易洗脫，造成

8、非特異性吸附。5PBS沖洗34次，每次10min。62.5%戊二醛再固定15min30min。7PBS液沖洗34次每次10min。8酶標(biāo)記抗體孵育；用適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗體(即工作濃度)于25濕盆內(nèi)孵育1h或4過夜。9PBS液沖洗34次每次10min或4漂洗過夜。10酶顯色處理 將漂洗后的標(biāo)本浸入DABH2O2底物溶液中，20，10min30min。顯色強(qiáng)弱與戊二醛的固定有關(guān)。若顯色弱則可減少甚至取消戊二醛的固定時(shí)間。沖洗時(shí)必須注意防止非特異漂浮的沉積。11常規(guī)包埋、切片、電鏡觀察 在經(jīng)過脫水包埋確定抗原性不致引起失活的前提下可在包埋切片后做標(biāo)記染色，切片一般在2m4m，切片后染色不存在通透困難的

9、問題。無論在標(biāo)記染色后切片還是在切片后標(biāo)記染色，最好在光鏡下定位選擇后，再做電鏡定位包埋，這樣目的性強(qiáng)，可減少工作量。（四）結(jié)果判定在已知陽性、陰性樣品成立的前提下，凡出現(xiàn)棕色顆粒，即指示抗原抗體的存在，同時(shí)可觀察到病毒顆粒的存在，判為陽性()，否則判為陰性()。三、鐵蛋白免疫電鏡技術(shù)原理 免疫鐵蛋白技術(shù)是以鐵蛋白標(biāo)記抗體，再以鐵蛋白抗體與待檢抗原作用。通過電鏡檢查，觀察到鐵蛋白抗體所在的位置，即抗原所在。（二）材料與試劑1馬脾鐵蛋白2硫酸銨3硫酸鎘4雙異氰酸鎘二甲苯(Metaxylene dlisocyante XC)以0.30Mol/L pH 9.5硼酸鹽緩沖液將XC配制成1%溶液。注意配

10、制的水及容器必須特別清潔，配制后放置4數(shù)天，以不出現(xiàn)沉淀為準(zhǔn)。如出現(xiàn)沉淀XC的多聚體形成，應(yīng)重配。50.30Mol/L pH 9.5硼鹽酸緩沖液60.1Mol/L硫酸銨液70.05Mol/L pH 7.4 PBS液（三）操作方法1鐵蛋白的提取 配制2%硫酸銨液，并以1Mol/L的NaOH或HCl調(diào)pH值，正好為5.85。取1g鐵蛋白溶于100ml的2%硫酸銨液中。 加入20%硫酸鎘，使最終濃度為5%，混勻，4過夜。 1 500g離心(4)2h，去上清。仍加2%硫酸銨至100ml，混勻，離心，去除不純沉渣。 于上清液中重新加入20%硫酸鎘，重復(fù)步驟，離心，去上清。 檢查沉渣，置顯微鏡下檢查，應(yīng)具

11、有典型的黃褐色結(jié)晶，結(jié)晶為六角形，雙一四點(diǎn)結(jié)構(gòu)，如結(jié)晶不典型，應(yīng)繼續(xù)重復(fù)以上步驟。 以少量的蒸餾水溶解，再加50%飽和硫酸銨溶液，使之沉淀，離心，去上清。 重復(fù)步驟一次。 以少量蒸餾水溶解,常水透析24h后,以0.05Mol/L pH 7.5PBS透析24h。 100 000r/min離心2h，去除上部無色上清液(約3/4總量)，置4過夜。 用微孔濾膜(孔徑0.45)過濾，使鐵蛋白含量為65mg/ml75mg/ml，分裝，4保存不要凍干保存,以免鐵蛋白結(jié)構(gòu)遭破壞。2鐵蛋白抗體交聯(lián)法 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸鹽緩沖液將鐵蛋白稀釋成20mg/ml25mg/ml。 以11000(W/W)

12、的比例加入XC液室溫?cái)嚢?5min，離心去沉淀。 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸鹽緩沖液將提純lgG配成5mg/ml，以14的比例(V/V)加入IgG與鐵蛋白XC液，4攪拌48h。 以0.1Mol/L碳酸銨溶液透析過夜，以除去多余的異氰酸鹽，再以0.05Mol/l pH 7.5 PBS透析，使pH值恢復(fù)到生理水平。 超速離心 以1.00105g離心5h，去上清，沉淀以0.05Mol/L PBS懸浮，再次離心，以除去未結(jié)合的IgG。 以血清學(xué)及免疫學(xué)方法測(cè)定結(jié)合抗體的特異性、免疫活性以及標(biāo)記效應(yīng)，如果操作步驟嚴(yán)格，結(jié)果是滿意的。3鐵蛋白抗體結(jié)合物處理標(biāo)本（1）將標(biāo)本以5%福爾馬林pH 7.

13、2(4)PBS液固定40min60min。（2）用冷的PBS液洗滌，離心。（3）如是組織塊，則在解剖顯微鏡下切成更小塊，放入試管中，加入鐵蛋白抗體結(jié)合物置室溫20min，不時(shí)振蕩,（4）以冷PBS液洗滌三次，離心。（5）沉淀以2.5%戊二醛固定20min，以PBS洗滌。（6）再以鋨酸固定，脫水包埋。也可以先超薄切片，再進(jìn)行鐵蛋白抗體結(jié)合物染色。操作如下： 將培養(yǎng)細(xì)胞以1%福爾馬林PBS液固定(4)。 PBS液洗滌離心。 以0.5ml,30%牛血清蛋白PBS液懸浮置入膠透析膜袋中，再將袋置于吸水劑粉末上，待牛血清白蛋白成膠狀物時(shí)，將透析袋移至2%戊二醛PBS液（pH7.5）中固定3h。 取出，切

14、成小塊，以PBS液洗滌。 置干燥器中以硅膠干燥。 包埋、切片、在水上收集切片置于經(jīng)4%牛血清白蛋白PBS液處理的披有膠膜的載網(wǎng)上(牛血清白蛋白的處理在于減少鐵蛋白結(jié)合物非特異性吸附于載網(wǎng)上)。 滴一滴鐵蛋白抗體結(jié)合物于載網(wǎng)上。 5min后，浮網(wǎng)于PBS液面,標(biāo)本面向下，以除去多余的結(jié)合物。 涼干后，滴一滴乙酸雙氧鈾或氫氧化鉛以復(fù)染。 水洗、晾干、電鏡觀察。（四）結(jié)果判定在已知對(duì)照樣品成立的前提下，凡是出現(xiàn)黑色的鐵分子顆粒即表示抗原的存在，判定陽性()，否則判為陰性()。四、非標(biāo)記抗體免疫電鏡技術(shù)原理 標(biāo)記抗體法雖然具有許多優(yōu)點(diǎn)，但也存在一些難以克服的問題，如標(biāo)記抗體的分子增大，對(duì)細(xì)胞膜和組織的

15、穿透力減弱；化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)對(duì)抗體和酶的活性有所影響；結(jié)合物中未標(biāo)記的抗體可與抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，影響檢測(cè)方法的敏感性等。不標(biāo)記抗體法可以避免上述的不利影響因素，通過一系統(tǒng)的非標(biāo)記抗體的免疫學(xué)反應(yīng)，對(duì)組織中的抗原進(jìn)行定位檢測(cè)。不標(biāo)記抗體法又可分為用標(biāo)記物顯示和不同標(biāo)記物顯示兩種方法。前者利用基因工程方法制備雙特異性抗體的F(ab)2，一個(gè)Fab片段與標(biāo)本中的抗原結(jié)合，一個(gè)Fab是抗體蛋白的結(jié)合片段。在抗體與標(biāo)本作用后，再加入鐵蛋白與抗體結(jié)合，從而顯示組織內(nèi)抗原的所在部位。后者則用磷酸鎢負(fù)染后，直接電鏡觀察。（二）材料及試劑1待檢病毒材料 如糞便，氣管分泌物、腦脊髓液、組織培養(yǎng)液等。2高速離心機(jī)3已知抗體

16、4磷鎢酸5瓊脂糖6其它（三）操作方法1經(jīng)典法（1）將被檢病毒材料0.9ml，加15110稀釋的特異性免疫血清0.1ml充分混合。（2）置37作用1h或371h后再置4過夜。（3）以17 000r/min23 000r/min離心90min。（4）吸去上清，將離心管口倒置于濾紙上，吸去殘留液體。（5）沉淀物中加少量H2O混懸，用3%磷鎢酸(pH6.0)負(fù)染20Sec30Sec，滴加于400目銅網(wǎng)Fomnvar膜上，用濾紙從銅網(wǎng)邊緣輕輕吸去多余的負(fù)染液。（6）在透射電鏡下4104倍觀察。2快速法(瓊脂擴(kuò)散法)（1）同經(jīng)典法(1)、(2)步驟，制備免疫復(fù)合物。（2）以生理鹽水或pH 7.2巴比妥緩沖液制備1%瓊脂糖，趁熱澆注于潔凈的載玻片上，每片3ml，待冷卻凝固后，在凝膠面上等距離放置直徑4mm玻璃珠數(shù)粒，再于凝膠面上澆注1%瓊脂糖2ml3ml，冷卻凝固后，取出玻璃珠，使凝膠形成凹孔。（3）將普通濾紙剪成2