芹菜素對自殺基因治療系統(tǒng)殺傷人黑色素瘤細(xì)胞株A375的增

1、芹菜素對自殺基因治療系統(tǒng)殺傷人黑色素瘤細(xì)胞株A375的增效作用全文格式統(tǒng)一，兩端對齊黃暨生收稿時(shí)間：2016-03-29作者簡介：黃暨生（1985-），男，博士研究生，E-mail：通訊作者：杜標(biāo)炎，男，博士，教授，E-mail： dubiaoyan基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號：81072906）、張廣獻(xiàn)2、譚宇蕙2、易華3、羅惠3、杜標(biāo)炎3（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)生化教研室，廣東 廣州 510006；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，廣東 廣州 510006）摘要：目的 研究芹菜素對單純皰疹病毒1型胸苷激酶/更昔洛韋（HSV1-tk/G

2、CV）單純皰疹病毒1型胸苷激酶/更昔洛韋（HSV1-tk/GCV）自殺基因殺傷人黑色素瘤細(xì)胞株A375的增效作用及其機(jī)制。方法 采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測芹菜素對A375（tk-）細(xì)胞生長的影響，及自殺基因治療系統(tǒng)聯(lián)合芹菜素對含20% A375-tk/GFP（tk+）細(xì)胞的tk+和tk-混合細(xì)胞的殺傷效應(yīng)的影響，流式細(xì)胞儀熒光示蹤法分析縫隙連接通訊（GJIC第一次出現(xiàn)縮寫名詞GJIC，需要標(biāo)注為細(xì)胞通訊連接（GJIC）功能、細(xì)胞凋亡變化。結(jié)果 芹菜素用A375細(xì)胞24，48，72h的IC50分別為86.34，25.81，11.16molL1，選用2.520molL1芹菜素進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)；

3、5，10，20molL1芹菜素聯(lián)合GCV組對腫瘤細(xì)胞的抑制率明顯比芹菜素組和GCV組高（P0.05），協(xié)同性分析金正均Q值分別為2.03，1.43和1.36；2.5，5，10molL1芹菜素處理A375細(xì)胞48h后，各組綠色熒光細(xì)胞比值為：0.3330.003，0.3930.006，1.1050.094，芹菜素各組比值均明顯高于空白對照組（P0.01）；芹菜素聯(lián)合GCV各組，與空白對照組、GCV組、芹菜素各組比較，可以增加細(xì)胞晚期凋亡率，趨勢與MTT結(jié)果一致。結(jié)論 芹菜素可以提高tk和tk混合細(xì)胞對GCV的敏感性，具有協(xié)同增強(qiáng)自殺基因系統(tǒng)殺傷效應(yīng)的作用，其機(jī)制可能與芹菜素能夠促進(jìn)A375細(xì)胞G

4、JIC功能及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。關(guān)鍵詞：芹菜素；黑色素瘤；自殺基因；縫隙連接通訊Synergistic Effect of Apigenin on Suicide Gene Therapy of Human Melanoma Cell Line A375HUANG Jisheng1, ZHANG Guangxian2, TAN Yuhui2, YI Hua3, LUO Hui3,DU Biaoyan3 (1. School of Fundamental Medical Science, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510

5、006 Guangdong, China; 2. Department of Biochemistry, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006 Guangdong, China; 3. Department of Pathology, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006 Guangdong, China）Abstract Objective To observe the enhancing effect and synergistic

6、 mechanism of Apigenin on HSV-tk/GCV suicide gene therapy anti-tumor effect on human cutaneous melanoma cell line A375. Methods Inhibitive effect of Apigenin on A375 cell, to determine the dosage of Apigenin, and bystander effects of suicide gene therapy system combined with Apigenin on mixed cells

7、of 1:4(A375-tk/GFP(tk+) : A375(tk-) were measured by MTT cytotoxicity assay, the gap junction function and apoptpsis of A375 was measured by flow cytometry and fluorescent trace method. Results 24, 48 and 72h IC50 of Apigenin to A375 cell were 86.34, 25.81, 11.16mol/L, 2.520mol/L of apigenin was use

8、d for subsequent testing; 5, 10, 20mol/L of apigenin combined tk/GCV group inhibition rate of tumor cells was significantly more than the single drug group and pure tk/GCV group (P0.05). The Q values were 2.03, 1.43 and 1.36; 2.5, 5, 10 mol/L of apigenin treatment of A375 cells after 48h, each green

9、 fluorescent cell ratio: 0.1560.034, 0.3330.003, 0.3930.006, 1.1050.094, the concentration of apigenin group was significantly higher than that of the control group (P0.001); apigenin combined with tk/GCV groups compared with the control group, tk/GCV group and apigenin group, the late period cell a

10、poptosis rate was increased, and the trend was consistent with the MTTResult. Conclusions Apigenin can improve the sensitivity to GCV of tk+ and tk- mixed cells, synergistic enhanced killing effect of the tk/GCV system, and its mechanism may be related to apigenin can promote A375 cell GJIC function

11、 and apoptosis.英文摘要有大量語言，文法等錯(cuò)誤，一看為基于中文直接翻譯的英文，需要好好修改英文Abstract: Objective To observe the enhancing effect and synergistic mechanism of apigenin on HSV1-tk/GCV suicide gene therapy on human melanoma cell line A375. Methods MTT assay was adopted to observe the inhibitive effect of apigenin on A375 cel

12、ls(tk-), and the anti-tumor effects of suicide gene therapy combined with apigenin on tk+ & tk- mixed cells with 20% A375-tk/GFP(tk+), the GJIC function and apoptosis of A375 cells was measured by flow cytometry and fluorescent trace method. Results IC50 of apigenin on A375 cells were 86.34, 25.81,

13、11.16molL1 in 24, 48, 72h, 2.520molL1 apigenin was selected for subsequent tests; the anti-tumor effect of 5, 10, 20molL1 apigenin combined with GCV groups were significantly more than apigenin groups and GCV group(P0.05), the Jins Q values of synergistic analysis were 2.03, 1.43, 1.36; after 48h tr

14、eatment of 2.5, 5, 10molL1 apigenin on A375 cells, the green fluorescent cells ratio of each groups were 0.3330.003, 0.3930.006, 1.1050.094, the ratio of apigenin groups were significantly higher than the control group(P0.01); compared with control group, GCV group and apigenin groups, the late peri

15、od cell apoptosis rate of apigenin combined with GCV groups on A375 cells were increased, and the trend was consistent with MTT results. Conclusions Apigenin can improve the sensitivity of tk+ & tk- mixed cells to GCV, synergistic enhance the anti-tumor effect of suicide gene therapy system, and the

16、 mechanism may be related to the promotion of GJIC function and apoptosis on A375 cells.Keywords: Apigenin, Melanoma, Suicide Gene, GJIC芹菜素（Apigenin，4, 5, 7-三羥基黃酮）是一種多羥基黃酮類化合物，廣泛存在于多種植物中，也是多種中藥如藜蘆、虎杖、紫花地丁、半枝蓮等的藥效成分1。芹菜素具有多種生物活性和廣泛的藥理作用，如抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥、抗菌抗病毒等2。已被報(bào)到對多種腫瘤如乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、皮膚癌、前列腺癌和血液系統(tǒng)等腫瘤具有一定的防

17、治效果3-5，抗腫瘤的機(jī)制主要有：抗氧化抗自由基、抑制細(xì)胞生長誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡、影響細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤新生血管等6-8。自殺基因療法是目前研究較深入、具有應(yīng)用前景的腫瘤治療新措施之一，但自殺基因同樣存在不足，需要通過增強(qiáng)旁觀者效應(yīng)來提高自殺基因療效：改善縫隙連接細(xì)胞通訊（GJIC）或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，或提高患瘤機(jī)體免疫功能，都有可能增強(qiáng)旁觀者效應(yīng)9。本課題組前期工作發(fā)現(xiàn)木犀草素、山奈酚10-11等黃酮類中藥活性成分在體內(nèi)外對自殺基因單純皰疹病毒1型胸苷激酶/更昔洛韋（HSV1-tk/GCV）系統(tǒng)有協(xié)同性增效作用，本研究旨在探討黃酮類中藥的活性成分芹菜素能否通過GJIC或細(xì)胞凋亡機(jī)制

18、而增強(qiáng)人黑色素瘤細(xì)胞自殺基因治療系統(tǒng)旁觀者效應(yīng)，探討中藥方藥活性成分聯(lián)合腫瘤自殺基因治療的可行性，現(xiàn)報(bào)道如下。1 材料和方法1.1 藥品及試劑 芹菜素，西安天寶生物科技有限公司，批號：TB20150919，純度98%，以二甲基亞砜（DMSO）溶解配成100mmolL1母液；全反式維甲酸（ATRA），美國Sigma公司，批號：080M1720V，以DMSO溶解配成50mmolL1母液，實(shí)驗(yàn)藥品均20避光保存，用時(shí)以完全培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)濃度；更昔洛韋（GCV）、四甲基偶氮唑鹽（MTT），美國Sigma公司；熒光染料DiI（V22885）和Calcein-AM（C3099）購自美國Invitroge

19、n公司；PI凋亡檢測試劑盒，日本DOJINDO公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、0.25%胰酶，美國Gibco公司；胎牛血清，以色列BI公司。1.2 主要儀器 Forma 371型CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo Fisher公司；IX71-F22FL/PH型熒光倒置顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)，日本Olympus公司；臺式高速低溫離心機(jī)，德國Eppendorf公司；Accuri C6流式細(xì)胞儀，美國BD公司Accuri C6流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；細(xì)胞培養(yǎng)板等耗材，美國Corning公司。1.3 細(xì)胞株 人皮膚黑色素瘤細(xì)胞株A375（tk-），美國ATCC公司；帶綠色熒光蛋白（GFP）及HSV1-tk自殺

20、基因的人皮膚黑色素瘤細(xì)胞穩(wěn)定整合株A375-tk/GFP（tk+）為本室構(gòu)建12，均培養(yǎng)于體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、100UmL1青霉素和0.1mgmL1鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置37和體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)至融合率為80%90%時(shí)傳代進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.4 芹菜素對A375細(xì)胞株生長抑制作用 將生長對數(shù)期的A375細(xì)胞消化后按3104 CellsmL1的密度接種到96孔板，每孔體積為100L。待細(xì)胞貼壁生長后，加入終濃度分別為0，6.25，12.5，25，50，100molL1的芹菜素培養(yǎng)液，作用24，48，72h后鏡下觀察細(xì)胞的變化。用MTT法檢測各組細(xì)胞的吸光度（D值），按公式P細(xì)胞抑

21、制率（%）=1-（D測定孔/D對照組）100%計(jì)算各組細(xì)胞抑制率，用Calcusyn 2.0軟件計(jì)算半數(shù)抑制量（IC50）。1.5 芹菜素聯(lián)合自殺基因系統(tǒng)對A375細(xì)胞的殺傷作用 將A375-tk/GFP（tk+）細(xì)胞和A375（tk-）細(xì)胞按1：4比例混合3104 CellsmL1的密度接種到96孔板（即20% tk+細(xì)胞），每孔體積為100L?；旌霞?xì)胞分為空白對照組、GCV組、芹菜素各組、芹菜素聯(lián)合GCV各組。待細(xì)胞貼壁生長后，加入終濃度分別0，5，10，20molL1的芹菜素培養(yǎng)液，0，5molL1 GCV培養(yǎng)液，作用72h后鏡下觀察細(xì)胞的變化。用MTT法檢測各組細(xì)胞的吸光度（D值），按

22、公式P細(xì)胞抑制率（%）=1-（D測定孔/D對照組）100%，計(jì)算各組細(xì)胞抑制率并進(jìn)行協(xié)同性分析比較各藥物組旁殺傷效應(yīng)大小。1.6流式細(xì)胞儀測定芹菜素對A375細(xì)胞GJIC)功能到底是GJ還是GJIC？容易混淆的影響 參考Goldberg13及Cazy14方法刪除采用熒光示蹤法測定GJIC功能。A375細(xì)胞按每孔105 Cells接種于24孔板，用2.5，5，10molL1芹菜素培養(yǎng)液或20，40molL1 ATRA處理細(xì)胞48h后，未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞用5molL1 DiI和5molL1 Calcein-AM共孵育30min作為供體細(xì)胞。將雙染的供體細(xì)胞按1:100比例接種到空白、芹菜素和ATR

23、A處理的各組受體細(xì)胞上，培養(yǎng)6h采用流式細(xì)胞儀分析GJIC功能。雙陰性受體細(xì)胞通過GJ被傳遞入綠色Calcein-AM熒光染料，以檢測接受Calcein-AM綠色熒光細(xì)胞數(shù)量占總數(shù)比值（PLR/LL），即綠色熒光細(xì)胞（PLR）/雙陰性受體細(xì)胞（PLL），作為評價(jià)GJIC功能的指標(biāo)，P越大，表示細(xì)胞間形成的GJ通訊功能越強(qiáng)。1.7 流式細(xì)胞儀觀察芹菜素對自殺基因殺傷誘導(dǎo)的A375細(xì)胞凋亡的影響 將tk+細(xì)胞和tk-細(xì)胞按1:4比例混合按每孔105 Cells接種于24孔板?；旌霞?xì)胞分為空白對照組、GCV組、芹菜素各組、芹菜素聯(lián)合GCV各組。待細(xì)胞貼壁生長后，加入終濃度分別為2.5，5，10mol

24、L1的芹菜素培養(yǎng)液，5molL1 GCV培養(yǎng)液，作用72h后鏡下觀察細(xì)胞的變化，有部分重復(fù)?？蓜h除前一句子中內(nèi)容。按PI試劑盒說明書操作，收集細(xì)胞加入預(yù)先配好的1PI Binding Solution，配成終濃度為106 CellsmL1的細(xì)胞懸液，取100L細(xì)胞懸液加入5L PI Solution，室溫下避光培養(yǎng)15min，加入400L1PI Binding Solution，1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡并熒光顯微鏡觀察拍照記錄。1.8 統(tǒng)計(jì)方法 用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均值標(biāo)準(zhǔn)差（xs）表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)。行距過大協(xié)同性分析采用金正均Q值法15，

25、公式如下（式中分子代表實(shí)測聯(lián)合藥效，分母代表理論聯(lián)合藥效）：Q=EA+B/(EA+EBEAEB)注意下標(biāo)表示;Q=EA+B/EA+EB-EAEB，EA、EB為單獨(dú)用藥藥效。Q0.85為拮抗作用；0.85Q1.15為相加作用；Q1.15為協(xié)同作用。2 結(jié)果2.1 芹菜素對A375細(xì)胞株生長抑制作用 圖1結(jié)果顯示，芹菜素對A375細(xì)胞生長有較為明顯的抑制效應(yīng)，6.25100molL1芹菜素對A375細(xì)胞殺傷作用呈時(shí)間和劑量依賴關(guān)系，24h，48h，72h的IC50分別為86.34，25.81，11.16molL1；本研究主要探討芹菜素通過GJIC或細(xì)胞凋亡機(jī)制增強(qiáng)對A375細(xì)胞自殺基因治療系統(tǒng)的旁

26、觀者效應(yīng)，故選用2.520molL1芹菜素進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。注：與0molL1組比較，P0.01圖1 芹菜素不同時(shí)間對A375細(xì)胞生長抑制的影響（XS，N=3）Figure 1 Effect of Apigenin on A375 cell growth under different concentrations and at different time point注：與0molL1組比較，*P0.05，,*P0.01圖1 芹菜素對A375細(xì)胞生長抑制的影響（xs，n=6）Figure 1 Effect of Apigenin on growth inhibition of A375 cell

27、s2.2 芹菜素對自殺基因治療系統(tǒng)殺傷A375細(xì)胞的增效作用 為了觀察芹菜素與HSV1-tk/GCV系統(tǒng)聯(lián)合作用的影響，選擇了旁觀者效應(yīng)較低而且單獨(dú)作用抑制率較低的20% tk+的混合比例，以及單獨(dú)作用對腫瘤細(xì)胞殺傷程度較輕的3個(gè)芹菜素濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。表1結(jié)果表明，芹菜素聯(lián)合GCV組對腫瘤細(xì)胞的抑制率明顯比相應(yīng)濃度芹菜素組和GCV組高（P0.05），說明芹菜素聯(lián)合自殺基因系統(tǒng)能顯著提高tk和tk混合細(xì)胞對GCV的敏感性，5，10，20molL1芹菜素聯(lián)合GCV組，Q值分別為2.03，1.43和1.36，均1.15說明芹菜素具有協(xié)同性增強(qiáng)tk/GCV系統(tǒng)殺傷效應(yīng)的作用。表1 芹菜素對tk/GCV自

28、殺基因治療系統(tǒng)的增效作用（XS，N=3）Table 1 Enhancing effect of Apigenin on tk/GCV suicide gene therapy system組別P實(shí)際抑制率/%理論抑制率Q值20%tk+對照組05molL1芹菜素組4.374.8210molL1芹菜素組24.722.7020molL1芹菜素組31.068.3120%tk+對照組+GCV組10.683.395molL1芹菜素+GCV組29.655.69*14.602.0310molL1芹菜素+GCV組46.796.46*32.781.4320molL1芹菜素+GCV組52.249.27*38.431

29、.36注：GCV均為5molL1P0.05，與20%tk+對照組比較；P0.01，與20%tk+對照組比較；P0.001，與20%tk+對照組比較*P0.05，與5molL1GCV組比較；*P0.01，與5molL1GCV組比較；*P0.01，與5molL1GCV組比較P0.05，單藥組與聯(lián)合組比較；P0.01，單藥組與聯(lián)合組比較；P0.01，單藥組與聯(lián)合組比較在我的印象中國內(nèi)藥理學(xué)雜志普遍只要求P0.05和P0.01兩種標(biāo)準(zhǔn)。表1 芹菜素對自殺基因治療系統(tǒng)的增效作用（xs，n=3）Table 1 Synergistic effect of Apigenin on suicide gene t

30、herapy system組別P實(shí)際抑制率/%P理論抑制率/%Q值空白對照組05molL1芹菜素組4.374.8210molL1芹菜素組24.722.7020molL1芹菜素組31.068.31GCV組10.683.395molL1芹菜素聯(lián)合GCV組29.655.69*14.602.0310molL1芹菜素聯(lián)合GCV組46.796.46*32.781.4320molL1芹菜素聯(lián)合GCV組52.249.27*38.431.36注：CGCV為5molL1與空白對照組比較，P0.05，P0.01；與GCV組比較，*P0.05，*P0.01；單藥組與聯(lián)合組比較，P0.05，P0.012.3 芹菜素上調(diào)

31、A375細(xì)胞的GJIC功能 圖3、圖4結(jié)果顯示：用20、40molL1 ATRA處理細(xì)胞48h后，對照組和試驗(yàn)組的綠色熒光細(xì)胞（PLR）與雙陰性受體細(xì)胞（PLL）比值（PLR/LL）分別是0.1560.034、0.1420.026、0.6470.002，40molL1 ATRA組比值均明顯高于空白對照組（P0.01）；用2.5，5，10molL1芹菜素處理細(xì)胞48h后，各組綠色熒光細(xì)胞比值為：0.3330.003，0.3930.006，1.1050.094，芹菜素各濃度組比值均明顯高于空白對照組（P0.01），表明芹菜素能促進(jìn)A375細(xì)胞的GJIC功能。隨著處理劑量的增加，2.510molL1

32、組被Calcein-AM標(biāo)記的細(xì)胞比例逐漸升高，相應(yīng)雙陰性細(xì)胞逐漸減少，作用具有濃度依賴性。注：與空白對照組比較，*P0.05，*P0.01；與40molL1 ATRA組比較，#P0.05，#P0.01圖3 芹菜素對A375細(xì)胞GJIC功能的影響（xs，n=3）Figure 3 Effect of Apigenin on GJIC function of A375 cells in different groupsA 空白對照組B 20molL1 ATRA組C 40molL1 ATRA組D 2.5molL1 芹菜素組E 5molL1 芹菜素組F 10molL1 芹菜素組圖4 各組對A375細(xì)胞

33、GJIC功能影響的流式細(xì)胞圖Figure 4 Flow cytometry results of GJIC function of A375 cells in different groups*圖形上有些統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)識未居中2.4 芹菜素促進(jìn)自殺基因殺傷誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡 圖5結(jié)果顯示，空白對照組細(xì)胞晚期凋亡率為4.5%，5molL1 GCV組細(xì)胞凋亡率為10.1%，經(jīng)2.5，5，10molL1濃度的芹菜素作用后，與空白對照組比較細(xì)胞凋亡率明顯增高，凋亡率分別為7.8%，10.4%，18.1%；將芹菜素聯(lián)合GCV組細(xì)胞凋亡率顯著升高，15.7%，21.9%，24.9%；芹菜素聯(lián)合GCV組細(xì)胞晚期

34、凋亡率比芹菜素組和GCV組升高，且作用具有濃度依賴性。PI單染檢測芹菜素對A375自殺基因系統(tǒng)細(xì)胞凋亡的影響趨勢與MTT結(jié)果一致，說明芹菜素對A375自殺基因治療系統(tǒng)有增效作用。A 空白對照組B GCV組C 2.5molL1 芹菜素組D 5molL1 芹菜素組E 10molL1 芹菜素組F 2.5molL1 芹菜素聯(lián)合GCV組G 5molL1 芹菜素聯(lián)合GCV組H 10molL1 芹菜素聯(lián)合GCV組注：CGCV為5molL1圖5芹菜素聯(lián)合自殺基因治療系統(tǒng)對細(xì)胞凋亡的作用流式細(xì)胞圖Figure 5 Flow cytometry results of apoptosis effect of api

35、genin combined with suicide gene therapy system圖5芹菜素聯(lián)合tk/GCV自殺基因治療系統(tǒng)對細(xì)胞凋亡的作用流式細(xì)胞圖對于PI單染的細(xì)胞凋亡圖難道凋亡的亞二倍體峰-凋亡峰不是在前面的嗎？這是PI染色嗎？如果是Annexin V染色到有可能說得通。Figure 5 Flow cytometry results for Apoptpsis拼寫有錯(cuò)誤 effect of Apigenin combined with tk/GCV suicide gene therapy system3 討論HSV1-tk/GCV自殺基因系統(tǒng)是最早進(jìn)入臨床試驗(yàn)的自殺基因系統(tǒng)

36、，在多種腫瘤（如白血病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膀胱癌、肝癌、結(jié)腸癌和口腔癌等）的治療中均顯示了一定的抗腫瘤效果16-17。惡性黑色素瘤是皮膚腫瘤中惡性程度最高的腫瘤，其常規(guī)治療手段主要是手術(shù)治療、放化療法、免疫治療等18。但常規(guī)治療手段未能獲得滿意的療效，隨著腫瘤自殺基因療法成為腫瘤生物治療中活躍的研究領(lǐng)域之一，應(yīng)用HSV1-tk/GCV自殺基因治療黑色素瘤成為一種較為有效且具有臨床應(yīng)用潛力的新策略19。本課題組前期研究了多種腫瘤自殺基因治療及中藥方藥對腫瘤自殺基因治療的增效作用及增效機(jī)制，已初步發(fā)現(xiàn)一些中藥活性成分山奈酚、木犀草素、大黃素等黃酮類化合物可提高腫瘤自殺基因治療的旁觀者效應(yīng)，其機(jī)制可能與促

37、進(jìn)腫瘤細(xì)胞GJIC功能有關(guān)9-10。縫隙連接機(jī)制，是自殺基因旁殺傷效應(yīng)的主要可能進(jìn)作用機(jī)制之一。細(xì)胞通過縫隙連接所進(jìn)行的信息物質(zhì)交換，即細(xì)胞間縫隙連接通訊，其對細(xì)胞生長、增殖、分化和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著重要調(diào)節(jié)作用20-21。本試驗(yàn)對極其相似的黃酮類化合物芹菜素進(jìn)行研究，前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，芹菜素具有協(xié)同性增強(qiáng)自殺基因系統(tǒng)殺傷效應(yīng)的作用。為了觀察芹菜素與自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合作用的影響，選擇了旁觀者效應(yīng)較低而且單獨(dú)作用抑制率較低的20% tk+的混合比例，以及對腫瘤細(xì)胞殺傷程度較輕的3個(gè)芹菜素濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。MTT結(jié)果顯示，芹菜素聯(lián)合自殺基因系統(tǒng)能顯著提高tk和tk混合細(xì)胞對GCV的敏感性。5，10，20mo

38、lL1芹菜素聯(lián)合GCV組，Q值均1.15，說明相應(yīng)濃度的芹菜素具有協(xié)同增強(qiáng)自殺基因系統(tǒng)殺傷效應(yīng)的作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞縫隙連接功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芹菜素可以通過促進(jìn)縫隙連接通訊的功能，且作用與濃度存在依賴關(guān)系。進(jìn)一步研究，PI單染法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示，各聯(lián)合組細(xì)胞晚期凋亡率比芹菜素組和GCV組升高，且作用具有濃度依賴性。PI單染檢測芹菜素對A375細(xì)胞自殺基因系統(tǒng)的細(xì)胞凋亡的影響趨勢與MTT結(jié)果一致，說明芹菜素對A375細(xì)胞自殺基因治療系統(tǒng)有增效作用。本研究對黃酮類中藥活性成分芹菜素與HSV1-tk/GCV自殺基因系統(tǒng)聯(lián)合增效的作用機(jī)制，本研究證實(shí)芹菜素可以促進(jìn)縫隙連接通訊的功能從而

39、起到協(xié)同自殺基因治療，對旁殺傷效應(yīng)具有增效作用，為中藥方藥及活性成分聯(lián)合自殺基因治療惡性腫瘤奠定了更好的體外研究基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)：Michihara S，Tanka T，Uzawa Y，et al. Puerarin exerted anti-osteoporotic action independent of estrogen receptor-mediated pathwayJ. Journal of Nutritional Science & Vitaminology，2012，58(3)：202-209.Batra P，Sharma AK. Anti-cancer potential o

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