蛋白質和氨基酸測定

1、關于蛋白質和氨基酸的測定第一張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月8-1 概述8-2 蛋白質的定性測定（自學）8-3 蛋白質的定量測定*（8-4 蛋白質的末端測定）8-5 氨基酸的定性測定（自學）8-6 氨基酸的定量測定*8-7 氨基酸的分離及測定第八章 蛋白質和氨基酸的測定第二張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月本章重點凱氏定氮法的原理及注意事項。蛋白質快速測定法有哪些？氨基酸總量的測定方法（甲醛滴定法）。第三張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 概述蛋白質是復雜的含氮有機化合物。蛋白質換算系數(shù)F 玉米、雞蛋、肉 6.25 花生 5.46 乳制品 6.38 大米 5.9

2、5 面粉 5.70 大豆及制品 5.71蛋白質平均含N量（15-17.6）為16% 。第四張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月不同的食品中蛋白質含量不一樣，一般動物性食品的蛋白質含量高于植物性食品。 雞肉 鴨 兔肉 牛肉 豬肉 帶魚 21.5 16.5 21.2 20.1 9.5 18.1大豆 稻米 菠菜 蘋果 黃瓜 牛乳 36.3 8.5 2.4 0.4 0.8 3.5第五張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月測定意義：評價食品的營養(yǎng)價值。為合理開發(fā)利用食物資源，提高產(chǎn)品質量，優(yōu)化食品配方及生產(chǎn)過程控制提供依據(jù)。第六張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月其中：凱氏定氮法最常用的

3、，國內外應用普遍。雙縮脲反應、染料結合反應、酚試劑法等多用于生產(chǎn)單位質量控制分析。國外：紅外分析儀在一般的常規(guī)檢驗中多進行氨基酸總量的測定，通常采用酸堿滴定法來完成。各種氨基酸的分離與定量色譜技術。有多種氨基酸分析儀。蛋白質的測定方法： 分兩大類 一類是利用蛋白質的共性即含氮量、肽鍵和折射率等測定蛋白質含量； 另一類是利用蛋白質中的氨基酸殘基（酸性和堿性基團、芳香基團等）測定蛋白質含量。第七張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 蛋白質的定性測定（自學）一、蛋白質的一般顯色反應電泳或紙層析之后用一些染料與蛋白質結合并變色。書中列舉了 5 種染料。二、復合蛋白質的顯色反應（一）糖蛋白的

4、顯色（3種方法）（二）脂蛋白的顯色（2種方法）第八張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月測定總氮量 N%F =粗蛋白質含量%因為：樣品中除蛋白氮外，可能還包括有非蛋白質含氮化合物，如核酸、含氮碳水化合物、生物堿、含氮類脂、卟啉和含氮色素等。第三節(jié) 蛋白質的定量測定！第九張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月一、凱氏定氮法 由Kieldhl于1833年提出，現(xiàn)發(fā)展為常量、微量、自動定氮儀法，半微量法及改良凱氏法。改良：氮的完全氨化，縮短時間，簡化操作。 主要改良催化劑及消化蒸餾裝置。第十張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）常量凱氏定氮法原理 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，

5、使蛋白質分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機氮轉化為氨與硫酸結合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出。用H3BO3吸收后再以標準HCl滴定或H2SO4溶液滴定。根據(jù)標準酸消耗量可以計算出蛋白質的含量。也可以用過量的標準H2SO4或標準HCl溶液吸收后再以標準NaOH滴定過量的酸。為什么？第十一張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月催化劑煮沸1、消化：NCOC + 濃H2SO4 （NH4）2SO4 + CO2 + SO2 + H2O 2、蒸餾與吸收： 2NaOH +（NH4）2SO4 2NH3+Na2SO4 + 2H2O 2NH3 + 4H3BO3 （NH4）2B4O7 +

6、5H2O 3、滴定：（NH4）2B4O7 + 5H2O + 2HCl 2NH4Cl + 4H3BO3 (注: NCOC, Nitrogen containing organic compounds )凱氏定氮法原理（方程式）整個過程分三步：消化、蒸餾與吸收、滴定第十二張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 消化加硫酸鉀 作為增溫劑，提高溶液沸點，純硫酸沸點 340，加入硫酸鉀之后可以提高至400以上。也可加入硫酸鈉，氯化鉀等提高沸點，但效果不如硫酸鉀。要防止暴沸第十三張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 加硫酸銅 作為催化劑。還可以作消化終點指示劑、蒸餾時堿性指示劑。還可以加氧化

7、汞、汞（均有毒，價格貴）、硒粉、二氧化鈦。 加氧化劑 如雙氧水、次氯酸鉀等加速有機 物氧化速度。第十四張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月凱氏定氮法注意事項圖：常量凱氏定氮消化及蒸餾裝置 a消化裝置 b蒸餾吸收裝置1、硫酸鉀 及硫酸銅的作用2、火候控制3、裝置的氣密性4、何時加堿5、難消化的 對策6、停止蒸餾第十五張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月自動回流消化蒸餾儀第十六張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 蒸餾與吸收消化液 + 40%氫氧化鈉加熱蒸餾，放出氨氣。 “以奈氏試劑”檢查。同時用4%硼酸吸收Nessler試劑，K2（HgI4）檢驗NH4+離子，析出黃色或紅棕

8、色沉淀。第十七張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月3. 滴定用HCl滴定用混合指示劑（甲基紅+溴甲酚綠或亞甲基蘭+甲基紅） 終點：藍色微紅色計算：F要根據(jù)樣品來源定 3學時第十八張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月說明及注意：本法可應用于各類食品中蛋白質含量測定（粗蛋白質）。結果準確，但費時。所用試劑溶液應用無氨蒸餾水配制。同時作一空白試驗，從消化開始到滴定 。消化時不要用強火，應保持和緩沸騰，以免粘貼在凱氏瓶內壁上的含氮化合物在無硫酸存在的情況下消化不完全而造成氮損失。第十九張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 消化時應注意不時轉動凱氏燒瓶，以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固

9、體殘渣洗下，并促進其消化完全。 樣品中若含脂肪或糖較多時，消化過程中易產(chǎn)生大量泡沫，為防止泡沫溢出瓶外，在開始消化時應用小火加熱，并時時搖動；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時注意控制熱源強度。 當樣品消化液不易澄清透明時，可將凱氏燒瓶冷卻，加入30過氧化氫 23 m1 后再繼續(xù)加熱消化。第二十張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月 般消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，但對于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品，如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸等時，需適當延長消化時間（如大豆粉）。有機物如分解完全，消化液呈藍色或淺綠色，但含鐵量多時，呈較深綠色。蒸餾裝置不能漏氣。蒸餾時，加熱

10、火力要穩(wěn)定，否則將發(fā)生倒吸現(xiàn)象。(NH4)2SO4 檢驗第二十一張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月蒸餾前加NaOH要足量，溶液應變?yōu)樯钏{色或黑褐色（Cu（OH）2、CuO、銅氨離子），如顏色不變可能堿不夠 。蒸餾完畢后，應先將冷凝管下端提離液面清洗管口，再蒸1分鐘后關掉熱源否則可能造成吸收液倒吸。H3BO3吸收液的溫度不應超過40，否則對NH3的吸收作用減弱而造成損失。 第二十二張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）微量凱氏定氮法1、原理、步驟及適用范圍同前2、與常量法不同點：樣品量、試劑用量 減少加入硼酸量由50 ml 10 ml,滴定用鹽酸濃度由0.1 mol/L 0.0

11、1 mol/L ,可用微量滴定管。3、蒸餾裝置見下圖 。第二十三張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月保持酸性第二十四張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十五張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月改良式微量凱氏定氮裝置 第二十六張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（三）自動凱氏定氮法1、原理及適用范圍同前 2、特點：（1）消化裝置用優(yōu)質玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時消化8個樣品，30分鐘可消化完畢。（3）自動：自動加堿蒸餾，自動吸收和滴定，自動數(shù)字顯示裝置?？捎嬎憧偟俜趾坎⒂涗洠?2分鐘完成1個樣。第二十七張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作

12、于2022年6月如何測定蛋白氮？ 先把非蛋白質的含氮物與蛋白質分開。一般多采用沉淀劑（CuSO4 + NaOH，或三氯乙酸 ），將蛋白質沉淀析出，經(jīng)過過濾（或離心分離），將沉淀物再用凱氏法測定含N量。 馬鈴薯含非蛋白氮多。乳中非蛋白氮的測定？ 第二十八張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月二、雙縮脲法 傳統(tǒng)的凱氏定氮法應用范圍廣，靈敏度高、準確，不要大儀器，但費時間，有環(huán)境污染。 快速方法： 雙縮脲法 紫外分光光度法 染料結合法 水楊酸比色法 紅外光譜法 考馬斯亮藍染料比色法 樣品消化轉化為銨鹽后，在一定條件下與水楊酸鈉和次氯酸鈉生成藍色化合物，660nm比色。 在酸性溶液中與蛋白質結合染

13、色，620nm吸收?？?、靈敏，干擾較少。 第二十九張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月1.原理 脲（尿素）NH2CONH2 加熱至150160時，兩分子縮合成雙縮脲。 雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫紅色絡合物，這種反應叫雙縮脲反應。 蛋白質分子中含有肽鍵 CONH ，與雙縮脲結構相似。在同樣條件下也有呈色反應，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質含量成正比，可用分光光度計來測其吸光度，確定含量。（560nm）NH2CONHCONH2 + NH3NH2CONH2 + NH2CONH2第三十張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月配合物：雙縮脲銅鈉氫氧化物 第三十一張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作

14、于2022年6月注：測蛋白質時叫雙縮脲法，并不另加雙縮脲。樣品不用消化可直接用粉樣，振蕩、顯色后離心。 2.方法特點及應用范圍 本法靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化學領域中常用。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測定。 3.主要儀器： 分光光度計，離心機 4. 試劑： (1) 堿性硫酸銅溶液 (2) 四氯化碳第三十二張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月5操作方法：采用凱氏法測出的蛋白質樣品為標準樣繪標準曲線。三紫外吸收法 1原理：利用蛋白質的特有基團，R（ NHCHCO） 對紫外光有吸收作用，在280 nm下，吸光度與蛋白質濃度成直線關系，求含量。第三十三張，PPT

15、共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月2適用范圍：常用于生物化學工作，因為干擾因素多，故在食品分析領域應用不廣泛。3主要儀器： 紫外分光光度計 離心機（3000 5000 r/min）4操作：用凱氏法測得結果的同類樣品作標樣做標準曲線。測牛乳 冰醋酸第三十四張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第五節(jié) 氨基酸的定性測定（自學）利用各種顯色反應（134138頁）第三十五張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月一、氨基酸的一般顯色反應 茚三酮法、吲哚醌法和鄰苯二甲醛法。前二種是經(jīng)典的常用顯色法，后一種是近年來發(fā)展起來的熒光顯色法。1.茚三酮法 氨基酸或蛋白質能與茚三酮作用，生成藍紫色化合物。2.吲

16、哚醌法 各種氨基酸與吲哚醌試劑能顯示不同顏色，因此可借此辯認氨基酸。3.鄰苯二甲醛法（最靈敏） 鄰苯二甲醛在2-巰基乙醇存在下，在堿性溶液中與氨基酸作用產(chǎn)生熒光化合物，最適的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別為340nm和455nm。在手提式紫外燈(254/365)下觀察。 各種氨基酸顯現(xiàn)的熒光強度不同。第三十六張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月二、個別氨基酸的顯色反應利用個別氨基酸與某些試劑具有特殊的顯色反應定性氨基酸。可應用于紙層析和紙電泳顯色。 精氨酸，胱氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸和羥賴氨酸、羥脯氨酸,色氨酸、酪氨酸、酪氨酸和組氨酸。第三十七張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年

17、6月第六節(jié) 氨基酸定量測定一氨基酸的一般定量測定（一）甲醛滴定法 1.原理：氨基酸本身有堿性 NH2 基，又有 酸性COOH基，成中性內鹽，加入甲醛溶液后，與NH2結合，堿性消失，再用強堿來滴定COOH基。（有多種寫法） 第三十八張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月2、測定 適量樣品于100ml容量瓶中（含氨基酸約20mg） 水定容 取20.0ml于燒杯中，加60ml水 用0.05mol/LNaOH滴至pH8.2（此體積可供計算總酸含量） 加10.0ml中性甲醛 NaOH滴至pH 9.2，記錄消耗體積V1。 空白試驗：80ml水 NaOH調至pH8.2 加10.0ml中性甲醛 NaOH滴

18、至pH9.2，耗V0ml。用酸度計電極的選擇？ 第三十九張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月3、說明本法準確快速，可用于各類樣品游離氨基酸含量測定。固樣先粉碎，稱量后用水萃取約半小時（50水浴）。銨鹽的存在使結果偏高，因其也與甲醛作用產(chǎn)生酸。也可用指示劑指示終點（中性紅、百里酚酞），但準確度稍差，對深色樣品要用活性炭脫色，但芳香族氨基酸易被吸附。 第四十張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月同時取兩份樣： + 中性紅指示劑，用氫氧化鈉直接滴，中和樣液中其它酸性物質。pH6.88.0 + 百里酚酞+ 中性甲醛+ NaOH 滴，中和了 樣液中氨基酸的羧基與其它酸性物質的總和。pH9.41

19、0.6 (淡藍色) 二者之差可計算氨基酸含量。第四十一張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）茚三酮比色法1、原理：氨基酸在堿性溶液中能與茚三酮作用，生成藍紫色化合物（脯氨酸反應成黃色），可用吸光光度法測定，=570nm。2、測定：樣品 水提取氨基酸，活性炭脫色（），過濾 分取澄清液于25ml比色管中 加茚三酮，pH8.04磷酸鹽緩沖液 水浴加熱15min 迅速冷卻，水定容 靜置15min 測A570，空白為參比。同時作標準曲線，氨基酸標液用某一干燥的氨基酸如異亮氨酸配制。3、結果：氨基酸含量（mg/100g）以所用標準氨基酸計 第四十二張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月二個別

20、氨基酸的定量測定介紹了8種氨基酸的定量測定方法見P147155第四十三張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月第七節(jié) 氨基酸的分離與測定 一薄層色譜法（TLC法）Thin Layer Chromatography簡介： 一種微量而快速的層析方法，它把吸附劑或支持劑均勻的鋪在玻璃板上成一薄層，把樣品點在薄層上，然后用合適的溶劑展開，從而達到分離、鑒定和定量的目的。因為層析在薄層上進行，所以稱為薄層層析。它的應用范圍比紙上層析更廣泛，常用來分析氨基酸、農(nóng)藥殘留量、黃曲霉毒素等。第四十四張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月（一）原理： 取一定量經(jīng)水解的樣品溶液，滴在制好的薄層板上，在溶劑系統(tǒng)中進行雙向上行法展開，樣品各組分在薄層板上經(jīng)過多次的被吸附、解吸、交換等作用，同一物質具有相同的Rf值，不同成分則有不同的Rf值，因而各種氨基酸可達到彼此分離的目的。然后用茚三酮顯色，與標準氨基酸進行對比，鑒別氨基酸種類，從顯色斑點顏色的深淺可以大致確定其含量。 第四十五張，PPT共五十一頁，創(chuàng)作于2022年6月Rf = a / bab樣點溶劑前