研究共振光散射技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用

1、研究共振光散射技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用摘要：對共振光散射技術(shù)在藥物與生物大分子分析測定中的應(yīng)用狀況及其進(jìn)展進(jìn)行了綜述。重點(diǎn)介紹了該方法在生物體液中藥物的分析和中藥成分的分 析應(yīng)用前景。為體內(nèi)大分子藥物及其他藥物成分的檢測方法研究提供了新途徑。 關(guān)鍵詞：共振光散射技術(shù)；藥物分析共振光散射(resonance light scattering , RLS)!利用普通熒光分光光度 法對散射光進(jìn)行測量的一種散射光分析技術(shù)。該技術(shù)由于其簡單、快速、靈敏的分析特點(diǎn)，吸引了生命科學(xué)、分析化學(xué)、環(huán)境科學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域的分析工作 者對其理論和應(yīng)用進(jìn)行了深入的研究， 促進(jìn)了分析學(xué)科內(nèi)部各個分支之間的，尤其是在生化

2、領(lǐng)域已經(jīng)取得一定的研究成果。光散射現(xiàn)象廣泛存在于光與粒子相互作用的過程中，當(dāng)介質(zhì)中粒子的直徑 (d)與入射光波長(入0)存在d0入0時，產(chǎn)生的是以瑞利(Rayleigh)散射為主的 分子散射光。根據(jù)RLS理論可以得到散射光強(qiáng)度與散射粒子的濃度 c成正比的關(guān) 系，即IRLS=Kcb據(jù)此可以用于大分子物質(zhì)溶液的分析測定。RLS分析法靈敏度高，操作簡單方便，可通過普通熒光分光光度計同步掃 描得到完整的RLS特征光譜和相應(yīng)RLS峰。由于RLS法源于Rayleigh散射光吸 收光譜，它對分子結(jié)構(gòu)大小和形狀(如球形、鏈形、無規(guī)則線團(tuán)等)、電荷分布、 鍵合性質(zhì)等研究還能提供新的、更豐富的信息。近年來的研究證

3、明，RLS法還可用于痕量金屬、表面活性劑以及納米材料4,5等方面的研究測定。該方法一般 不需要對樣品進(jìn)行復(fù)雜的化學(xué)預(yù)處理， 避免了一系列煩瑣的操作程序，而直接將 處理好的樣品溶液置于普通的熒光分光光度計中進(jìn)行測定即可。1體液中生物大分子的測定 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的功能很多，與生命的起源和生物的進(jìn)化、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、病毒、免疫、 酶、激素、物質(zhì)的遺傳等有密切的，它是生命現(xiàn)象的物質(zhì)基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)定量測定 是生物化學(xué)和生命學(xué)科中經(jīng)常涉及的分析內(nèi)容，在臨床醫(yī)學(xué)中也有重要應(yīng)用。目 前，蛋白質(zhì)測定方法主要有 Lowry法，Bradford法，Biuret法，Bromoeersol Green 法與Bormophenol

4、 blue法等。Pasetmack將RLS技術(shù)用于測定微量蛋白質(zhì)以來， RLS法分析技術(shù)以其方法簡單、快速、靈敏度高，在生物大分子分析測定研究中 的報道日益增多，靈敏度可達(dá)納克級11。黃承志等研究了陰離子表面活性劑羅丹明 B(Rhodamine B, RhB)十二烷基硫酸鈉灼 蛋白質(zhì)體系的RLS光譜特征。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SDSt HSA（humarserum albumin , HSA結(jié)合后再與RhB作用，具散射光強(qiáng)度增強(qiáng)。且 RLS增強(qiáng)的程度與 蛋白的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。據(jù)此，建立了一種測定人血清中總蛋白質(zhì)的新方法12 0胡之德等基于在的酸性溶液中，聚乙二醇辛基苯基醴（OP）對亮麗春紅5R

5、蛋白質(zhì)體系的RLS信號有強(qiáng)烈的增敏現(xiàn)象，建立了 0P蛋白質(zhì) 亮 麗春紅5R三元體系測定人血清中蛋白質(zhì)濃度的新方法。該體系對人血清白蛋白 檢測的線性范圍在pg - ml-1之間，檢測限為ng - ml-1 ,檢測實(shí)際樣品的回 收率在7%之間，方法令人滿意13。王錫寧等利用RLS技術(shù)測定白蛋白、紅蛋 白。研究了間苯二酚黃QP蛋白質(zhì)體系RLS光譜特性，確定了在nm處，問苯二酚黃濃度為X 10-5 mol - L-1 , OP的濃度為X 10-5 mol - L-1時為最佳反應(yīng) 條件，據(jù)此建立了一種靈敏度高的測定蛋白質(zhì)的新方法14。薛蓿等研究了流動注射介1DHLS技術(shù)聯(lián)用在線測定人血清中蛋白質(zhì)含量。以

6、SDS為熒光探針，利用未曾報道過的RLS與FIA聯(lián)用檢測人血清樣品中蛋白質(zhì)含量。與單純用RLS法測定比較，分析時間由40 min縮短至1 min, RLS信號的重現(xiàn)性得到了顯著改 善，提高了實(shí)驗(yàn)的靈敏度和重現(xiàn)性15 o梁宏等在普通熒光分光光度計上選擇合 適的激發(fā)光和發(fā)射光通帶寬度，利用RLS技術(shù)，研究了生理pH值（土）, 25 C下， 金（田）與血清白蛋白的相互作用。首次觀測到金（田）對血清白蛋白的RLS強(qiáng)度隨 著金（田）濃度增加而降低。結(jié)果表明，金（田）與血清白蛋白的結(jié)合會破壞血清白 蛋白分子聚集，使血清白蛋白中的二硫橋鍵斷裂， 導(dǎo)致白蛋白分子趨于松散，散 射截面積減小，表現(xiàn)為RLS強(qiáng)度降低

7、16。核酸核酸是遺傳信息的載體和基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)，在生物的生長、發(fā)育等活 動中具有十分重要的作用。目前核酸分析測定的方法主要有分光光度法、熒光光度法、化學(xué)發(fā)光法、探針技術(shù)法、免疫分析法等，其中分光光度法17和熒光光度法18使用較多。紫外分光光度法操作簡單，但由于靈敏度低，測定的干擾因 素多，使其在應(yīng)用上受到了限制；熒光分析法具有選擇性好和靈敏度高，但熒光 試劑價格昂貴，而且部分熒光試劑有致癌活性。針對上述情況，RLS法因操作簡便快速，靈敏度高，試劑無毒性等優(yōu)勢，在核酸分析中也得到了廣泛的應(yīng)用。黃承志等利用澳化十六烷基三甲俊i y I t-,ir-：； i.liy lu.rirons i J

8、iibromide,CTMAB）陽離子表面活性劑，核酸因帶有大量的磷酸根而帶負(fù)電荷的特 性，證明了 CTMA則核酸通過靜電引力共吸附到液/液界面上形成兩性復(fù)合物， 導(dǎo)致強(qiáng)烈增加的全內(nèi)反射共振光散射 （total internal reflected resonance light scattering 虛吸5信號，TTR RLS信號強(qiáng)度與核酸的濃度呈線性19。 劉紹璞等研究了 5種陽離子表面活性劑與核酸反應(yīng)的 RLS光譜20。陳展光等首 次利用諾氟沙星做為RLS光譜探針，測定了葉綠體脫氧核糖核酸（ctDNA） 0在的 XRWn代山計緩沖溶液中，波長nm處出現(xiàn)最大RLS峰，ctDNA的線性 響應(yīng)

9、范圍為1 g - ml-1 ,檢測限為ng - ml-1。還合成了希夫堿試劑三已（:鄰羥基苯基亞甲氨基）乙基）胺，并且研究了其與核酸在鹽酸介質(zhì)中的反 應(yīng)。對希夫堿劑三（2 （:鄰羥基苯基亞甲氨基）乙基）胺）岫 體系的研究發(fā)現(xiàn)，在處增加的RLS強(qiáng)度與核酸的濃度成線性關(guān)系（ctDNA,仙g ml-1;fsDNA , N g - mL1）。ctDNA的檢測限是 ng - mL1 , fsDNA的檢測限是 ng - mL1。結(jié)果 與紫外可見分光光度法測得結(jié)果一致21。林楓等研究在介質(zhì)中加入DNAK 陽離子表面活性劑可使二甲酚橙的 RLS增強(qiáng)，據(jù)此建立了以二甲酚橙為分子探針 測定DNAB分析方法，適用于

10、合成樣品中的 DNAW定22。2在化學(xué)藥分析中的應(yīng)用黃承志等利用具有雙親性的RhBCTWAB全內(nèi)反射共振光散射法測定肝素，肝素通過與 RhB和CTMABI互作用 形成三元雙親性的復(fù)合物RhB肝素C1BR,而被RhB和CTMAB、同吸附在水/ 四氯化碳（H2O/CCl4）界面上，引起強(qiáng)烈的TTR RLS增強(qiáng)信號用于肝素的測定 19。陳展光等在氧氟沙星茜素紫3B體系中發(fā)現(xiàn)，的BR緩沖溶液中，在nm處，Ngml-1范圍內(nèi)的氧氟沙星與增加的 RLS強(qiáng)度成線性關(guān)系。與此同時， 在，nm處，n g ml-1范圍內(nèi)的氧氟沙星與RLS強(qiáng)度成線性關(guān)系，檢測限分 別為pg - ml-1 , n g ml-121。

11、氧氟沙星 茜素紫3B體系可用于人體的氧 氟沙星血藥濃度測定。還建立了人血清中抗菌類四季俊化合物的 RLS技術(shù)檢測方 法23。陳展光等，建立的二澳羥基苯基熒光酮。用HW 曲通仃川力工100 舟的共振光散射光譜新體系，分析測定了中藥、頭發(fā)以及水中的微量鑰21 o劉 云富等研究發(fā)現(xiàn)在硫酸介質(zhì)中，神舟雜多酸與堿性染料RhB締合導(dǎo)致RhB體系的 RLS強(qiáng)度減弱，在一定濃度范圍內(nèi)，種（V）的含量與體系減弱的RLS強(qiáng)度成線性 關(guān)系，據(jù)此建立了 RLS技術(shù)測定神（V）的新方法24。3在中藥分析中的應(yīng)用黃承志等，研究了熒光素（臼匕）小集堿（BE）全內(nèi)反射共振光散射法測定小 集堿。采用TTR RLS技術(shù)通過Flu

12、與BE在水/1,2,二氯乙烷（H2O/DCE界面反應(yīng) 研究了 BE在界面上的特性。Flu與BE形成雙親性的復(fù)合物，在 H2O/DC/面富 集，并引起強(qiáng)烈增加的TTR RLS信號，最大吸收波長位于nm,所得信號強(qiáng)度在 一定范圍內(nèi)與BE濃度成正比關(guān)系，檢測限為 ng mL1。本方法與藥典使用的 HPLCT法對照靈敏度有所提高19。張憶華等，在pH為的Tris緩沖溶液中建 立了綠原酸 CTMAE 體系，實(shí)驗(yàn)表明，nm處增強(qiáng)的RLS光強(qiáng)度（AIRLS） 穩(wěn)定，在pgmL-1的濃度范圍內(nèi)，體系 AIRLS與ctDNA的濃度具有良好的 線性關(guān)系，檢測限為ng - mL1o在厚樸酚 仃肺 clDA體系中，選

13、擇pH值 為的Tris緩沖溶液來控制反應(yīng)體系的酸度，nm作為定量分析的波長。在 pg mL1的濃度范圍內(nèi)，AIRLS與ctDNA的濃度具有良好的線性關(guān)系。在最佳 反應(yīng)條件，nm處，時，兒茶素 CTVIAB ClDA體系在g - mL-1的濃度范 圍內(nèi)，AIRLS與ctDNA的濃度成線性關(guān)系。類似的實(shí)驗(yàn)還有山奈酚CTVIAB clDA體系。止匕外，張憶華還研究了三價稀土離子與奧皮素、山奈酚 所形成的絡(luò)合物的RLS光譜，研究了 ctDNA對它的淬滅作用。建立了 Th3+/E3- 能皮素岫體系以及Ib3+./Eu?+山奈酚 MDNA體系，結(jié)果表明，柳皮素 與山奈酚通過配位作用與Tb3+/Eu3+結(jié)合

14、，引起體系RLS光強(qiáng)度的增力口，而當(dāng)加 入ctDNA后，體系的RLS光強(qiáng)度降低，原因是ctDNA結(jié)構(gòu)中的磷酸骨架可以與 Tb3+和Eu3儂生螯合作用，導(dǎo)致溶液中ctDNA和山奈酚與Tb3+/Eu3+的競爭配位。 該方法取得了明顯的實(shí)驗(yàn)成果25。4結(jié)語由于RLS技術(shù)是建立在普通光譜法基礎(chǔ)上，分析結(jié)果雖然是物質(zhì)的散射光 譜信息，但物質(zhì)形態(tài)特征等卻不能被獲取。基于此問題，一種結(jié)合顯微成像技術(shù)的共振光散射成像技術(shù)被建立起來，對生物大分子的聚集形態(tài)進(jìn)行了深入的研究 和探討26,儀器的性能和工作條件對所獲信號影響大。由于RLS光譜在較大光譜通帶下獲得，因而不利于光譜精細(xì)結(jié)構(gòu)的研究。雖然我們知道散射光強(qiáng)度與

15、散 射粒子濃度有關(guān)，但出發(fā)點(diǎn)是從同步光譜開始的，顯然其測定公式推導(dǎo)并未涉及 RLS的散射本質(zhì)。因此，用于分析化學(xué)的RLS技術(shù)原理與定量基礎(chǔ)尚未有定論。雖然RLS技術(shù)作為一種新興的分析測定技術(shù)存在一些不足，但隨著RLS技術(shù)理論 和應(yīng)用上研究的深入，使RLS技術(shù)不斷朝著痕量、高效、微觀和自動化方向發(fā)展， 極大地提高了 RLS技術(shù)分析法的靈敏度，選擇性和特異性，應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大。 已報道的有關(guān)藥物的RLS分析方法主要涉及如下藥物：肝素27、地唾氯俊23、 鹽酸小集堿28、多糖29、產(chǎn)丁 30、氨基糖甘抗生素31、青霉素32等。 除了一些常規(guī)的測定藥物的 RLS方法之外，近幾年還發(fā)展了以下幾種方法12

16、: RLS成像技術(shù)、FTA RLS技術(shù)、雙波長比率RLS技術(shù)等。RLS技術(shù)以其更靈敏、 更方便，不需要熒光物質(zhì)的特定體系等優(yōu)勢，必將更好地為藥物分析測試服務(wù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】PASTERNACK R F,COLLINGS P J. Resonance light scattering: A new technique for studying chromophore aggregationJ. Science,1995,269: 935-9.HUANG C 乙LI K A,TONG S Y. Determination of nucleic acids by aresonance - ight s

17、i.tTering technique witha , B , 丫 , 6 tctfcLisr4 (itIdc .liylatimioniunnD phony 1 porjhincTj- +) 199 6,68: 2259-2263.HUANG C Z,LI Y F. Resonance light scattering technique used for biochemical and pharmaceutical analysisJ.AnalChim Acta, 20XX,500(1-2):105-117.蔣治良，劉紹璞，劉慶業(yè).碳納米微粒的共振散射光譜研究J.應(yīng)用化 學(xué)：20XX,19

18、(1): 22-25.鐘福新，蔣治良，李芳，等.CoFe204rt米粒子的共振散射光譜研究J.光 譜學(xué)與光譜分析：20XX,20(5): 724-726.LOWRYO H,ROSEBROUGIJ,FARR A L, et al. Protein measurement with the Folin phenol reagentJ.J Biol Chem,1951,193: 265-275.BRADFORM M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizi

19、ng the principle of proteindye bindingJ.Anal Biochem,1976,72: 248-254MATSUSHITA M,RINO T,KOMODA T. Determination of proteins by a reverse biuret method bined with the copperbathocuproine chelate reactionJ. Clin Chim Acta,1993,216(1-2): 103-111.DOUMAS BT,PETERS T J. Serum and urine albumin: a progres

20、s report on their measurement and clinical significanceJ.Clin Chim Acta,1997,258(1): 3-20.LIANG X H,ZHANG Y N,WANG Y J,et al. Analysis of translocation of the CagA protein and induction of a scattering phenotype in AGS cells infected with helicobacter pyloriJ.Biomedical and Environmental Sciences ,

21、20XX,22(5):4-400.11 HUANG C Z,LI Y F,LIU X D. Determination of nucleic acids at nanogram levels with safranine T by a resonance light scattering techniqueJ.Anal Chim Acta,1998,375: 89-97.12黃承志，陳彪.共振光散射技術(shù)在蛋白及其藥物分析中的應(yīng)用研究 D.重慶：西南大學(xué),20XX.13胡之德，薛蓿.共振光散射新方法定量分析蛋白質(zhì)D.蘭州：蘭州 大學(xué).20XX.14王錫寧，戚瑞玲，邢金川.利用共振光散射技術(shù)測定白

22、蛋白、紅蛋白方 法的探討J.預(yù)防醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)信息，20XX,9(4): 423-426.15薛蓿，胡之德.流動注射一共振光散射技術(shù)聯(lián)用在線測定人血清中蛋 白質(zhì)含量J.蘭州大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),20XX,44(2): 142-143.16宋王爭，梁宏.金(田)與血清白蛋白的共振散射光譜研究J.廣西 師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),20XX,20(4): 68-70.17李天劍，沈含熙，羅云凈.乙基紫標(biāo)記分光光度法測定脫氧核糖核酸 J. 分析化學(xué)，1998,26: 1372-1375.18 CI Y X,LI Y Z,LIU X J. Selective determination of DNA by

23、itsenhc.ncement effecT. on thenorescerce the tetreicycl i neplexJ.Anal Chim Acta,1995,67: 1785-1788.19黃承志，龐小兵.共振光散射新技術(shù)在生化和藥物分析中的應(yīng)用研究 D.重慶：西南師范大學(xué)，20XX.20 LIU S P,HU X L,LUO H Q,et al. Resonance Rayleigh scattering spectral characteristics of interaction of nucleic acids with some cationic surfactants

24、 and their analytical applicationsJ.Science In China (Series B),20XX,45(2): 173-183.21陳展光，張?zhí)?共振光散射技術(shù)在生化分析與藥物分析中的研究及 應(yīng)用D.汕頭：汕頭大學(xué)，20XX.22林楓，劉利軍，馮寧川.二甲酚橙共振光散射法測定 DNAJ.中國醫(yī) 藥工業(yè)雜志,20XX,36(9): 557-559.23 CHEN Z G,PENG Y R,CHEN J H. Determination of antibacterial quaternary ammoniumpound in lozenges and hu

25、manserum by resonance light scattering techniqueJ.J Pharm Biomed Anal,20XX,48: 946-950.24劉云富，李貴榮，譚廣輝.人發(fā)中微量種共振光散射法測定J.中國 公共衛(wèi)生,20XX,24(2): 253-254.25張憶華，李娟.共振光散射光譜法在生物大分子檢測中的應(yīng)用研究D.吉林：吉林大學(xué),20XX.26黃承志，王斌.共振光散射在核酸及生物分析中的應(yīng)用D.重慶： 西南大學(xué),20XX.27賀薇，李原芳，譚克俊，等.金納米棒與肝素相互作用的表征及肝素 的等離子共振光散射分析法J.科學(xué)通報，20XX,52(24): 2840-2845.LIU S P,FENG P. Resonance rayleigh scattering for thedetermination of Berberine in tablet form with some acidic xanthene fluorescent dyesJ. Mikrochim Acta, 20XX,140(3-4): 189-193.ZHANG S Z,ZHAO F L,LI K A,et al. A study on the interaction between concanavalin A