TripleTOF高分辨質(zhì)譜在單克隆抗體藥物完整分子量測定及輕重鏈分析中的應(yīng)用

1、質(zhì)譜方法：高流速分析時TripleTO將液體導(dǎo)入廢液，避免鹽進(jìn)入質(zhì)譜。而低?間質(zhì)譜(TOF)，由于其具有極佳的分辨率及質(zhì)量測定范圍，因此特別a)。TripleTOF5600系統(tǒng)的分析質(zhì)量上限為40,000Da，在此質(zhì)量范圍:圖1)。本次測定上樣量為10Pg，采用了一個15分鐘，流速為200PL/的質(zhì)譜圖可以測定蛋白的完整分子量，并提供蛋白中異質(zhì)糖基化的額外廠二二三二一應(yīng)用實(shí)例I：TripleTOF高分辨質(zhì)譜在單克隆抗體藥物完整分子量測定及輕重鏈分析中的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)設(shè)計樣品制備：將單抗Anti-Actin(mouselgG2isotype,cloneAC40,Sigma)溶解于含30%ACN和0.1

2、%FA的溶液中，溶液用30KD超濾膜(Millipore,P/NUFC503096)離心過濾，根據(jù)鹽及去垢劑含量，重復(fù)以上操作3至8次。單抗樣品用DTT在60C下反應(yīng)35分鐘后切斷二硫鍵，以得到重鏈及輕鏈用于LC-MS分析。高流速液相色譜方法：在島津液相色譜系統(tǒng)上利用C8ZORBAXPoroshell色譜柱(Agilent,300SB-C8,1.0mmx75mm,5Pm)對完整抗體、重鏈、輕鏈進(jìn)行快速分析。液相色譜梯度如表1右所示，流動相A：2%乙腈,0.1%FA，流動相B：98%乙腈,0.1%FA。低流速液相色譜方法：利用EksigentnanoLC-Ultra和cHiPLC-nanofle

3、x納升液相系統(tǒng)對完整單抗樣品進(jìn)行分析。富集柱：ChromXPC4-CL3Pm,300A,0.5mmx200Pm，分析柱：ChromXPC4-CL3Pm,15cmx75Pm。梯度如表1左所示，流動相A：2%乙腈，0.1%FA，流動相B：98%乙腈，0.1%FA。Time(mins)%SolventB155表1.LCMS液相梯度：右部分-快流速液相色譜梯度表；左部分-納流液相色譜梯度表。0采用TurboV離子源，在分析最初的2分鐘時間內(nèi)利用分流閥分析時TripleTOF5600采用納升離子源。數(shù)據(jù)處理：利用BioAnalysLM中的貝葉斯算法進(jìn)行去卷積處理以得到蛋白的完整分子量?？贵w藥物完整蛋白分

4、析電噴霧離子源(ESI)結(jié)合飛行時li適合分析分子量較大的蛋白(150kD;內(nèi)能夠輕松檢測經(jīng)電噴霧電離后的蛋白多電荷離子。采用TripleTOF5600液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)的一級質(zhì)譜掃描模式測定單抗樣品anti-actin的完整分子量(min的快速梯度進(jìn)行分析。通過高質(zhì)量的細(xì)節(jié)信息(圖1)。此外，當(dāng)譜圖因?yàn)閱慰寺】贵w的多樣性（連接上不同種類的修飾）形成極為復(fù)雜的多電荷峰時，為了取得高準(zhǔn)確度的測定結(jié)果，除了高質(zhì)量的質(zhì)譜數(shù)據(jù)之外，還需要一款強(qiáng)大的去卷積軟件。BioAnalysLM軟件的貝葉斯蛋白分子量重建工具能夠在進(jìn)行貝葉斯蛋白重建計算之前，為高度復(fù)雜譜圖中的質(zhì)譜峰進(jìn)行更準(zhǔn)確的峰模擬，以提供更精確的蛋白分

5、子量計算結(jié)果。高靈敏度分析：本文同樣考察了TripleTOF5600結(jié)合快速液相色譜系統(tǒng)時在較小樣品上樣量情況下的靈敏度。當(dāng)上樣量僅為1也時仍能得到質(zhì)量極佳的質(zhì)譜數(shù)據(jù)（圖2）。NanoflowLCno70401002500HighflowLCIttIT*f|価1廣Jthj”片.F1.EmT*T1n亡1直IM430ngmAboncotumn(200fmo)15ngmAboncolumn(100fmol)7.5ngmAboncolumn(50fmol)MB10ugmAb圖2.單克隆抗體Anti-Actin在兩種流速下，三彳下，TripleTOF5600系統(tǒng).IgG上樣量為7.5-30ng時所得質(zhì)譜

6、圖。局部放大圖顯示了該況程中產(chǎn)生異質(zhì)性的主要RPPoroshell色譜柱分的質(zhì)譜圖及去情分使隆抗樣量部一oncolumn三種不同進(jìn)樣量情況時的質(zhì)譜圖即仍然顯示了極佳的靈敏度。（上圖）高流速下蛋白igG上樣量為1-10Pg時所得克克在低上50lkDa?及輕鏈（25kDa）的色i積后精確分子量質(zhì)譜圖。氐流W重鏈及輕鏈的表征約20%的人類抗體的糖基化修飾發(fā)生在可變區(qū)域0-LC/MS是用來分析抗體上糖型的準(zhǔn)確分子量及生產(chǎn)過顯示，抗體anti-actin經(jīng)變性并還原后在5也上樣量的情況下通過C8-圖3和圖4分別顯示輕鏈及重鏈1斟U0Q館t陽瞬洲阿紳卿測輕鏈質(zhì)譜圖顯示該部分均一性相對較高（圖3中）。輕鏈部

7、分的多電荷峰分布十分整齊，去卷積后的譜圖只有少數(shù)幾個主峰。與主峰相差17Da的峰是由于發(fā)生了抗體中常見的焦谷氨酸轉(zhuǎn)化所造成的（圖3右）。4.0e61000。上部分顯示色譜分離的輕鏈及重鏈經(jīng)子量的質(zhì)譜圖，其精確分子量卷4143O的原因，因此重鏈的質(zhì)譜圖表現(xiàn)出較輕鏈更明圖有非常復(fù)雜的多電荷峰，是因?yàn)樵?97號的天冬酰胺上發(fā)生不同分子量的多糖而形成。分子量相圖3.LC/MS輕鏈LC/MS表下部為去卷積后得到輕鏈而因?yàn)橛刑腔揎棃D有韭常一峰正是因?yàn)橘|(zhì)譜檢測后的Da與之偏差7部為輕鏈的一級質(zhì)譜圖。氨酸轉(zhuǎn)化所造成。yro-u上圖）。重鏈譜Da抗體上連接了了不同的糖差約162或:203的不均一性（圖4，化

8、修飾。去卷積后的圖譜證實(shí)幾個主D表明多糖結(jié)構(gòu)上具有不同的糖。400顯示重鏈仍do2?-uBu_結(jié)論圖4.LC/MS重鏈LC/MS表征。上圖下圖為去卷積后得到重鏈分子量的質(zhì)譜圖，顯示了因不同糖型導(dǎo)致的非均一性。,m/zTDaTripleTOF5600質(zhì)譜系統(tǒng)為抗體類藥物分析提供了完美的解決方案。高質(zhì)量的質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)合具有精確去卷積算法的BioAnalysL軟件能為抗體類藥物的分子量測定，糖基化修飾比例，N段封閉研究，焦谷氨酸轉(zhuǎn)化等修飾的表征提供準(zhǔn)確的結(jié)果。降低樣品消耗，即使在上樣量非常小的情況下仍能獲得氨酸轉(zhuǎn)化等修飾TripleTOF5600系統(tǒng)的高靈敏度能有效質(zhì)譜數(shù)據(jù)。(oR.JeVeris,GlycosylatiofrecombinL.Huang,S.Biolsi,K.Rales,U.Kiclearanee:AnLC/MScharacterization飯u0)-4參考文獻(xiàn)AHexNAcantantibodytherapeutics