Southernblot實(shí)驗(yàn)方法和操作步驟

1、SouthernBlot原理及實(shí)驗(yàn)方法SouthernBlot原理及實(shí)驗(yàn)方法原理：將待檢測(cè)的DNA分子用/不用限制性內(nèi)切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，從而顯示出待檢的片段及其相對(duì)大小。用途：檢測(cè)樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態(tài),如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它試劑和器材一、試劑變性液：1.5mol/LNaCl，0.5mol/LNaOH。中和液：0

2、.5mol/LTris-HCl(pH=7.5)，1.5mol/LNaCl。20DSSC：3mol/LNaCl，0.3mol/L檸檬酸鈉。以上溶液均在100Kpa滅菌20分鐘。2DSSC：用無菌移液管吸取20DSSC溶液5mL，加無菌水45mL。6DSSC：用無菌移液管吸取20DSSC溶液15mL，加無菌水75mL。二、器材22CmD15Cm瓷盤操作方法在瓊脂糖凝膠上電泳分離相（放一標(biāo)尺，可從像片中讀出將凝膠置于200mL變性液中，浸泡變?yōu)閟s-DNA，然后用重蒸水沖洗凝膠幾次。用中和液浸泡凝膠并不斷地振蕩纖維膜。取一個(gè)瓷盤，在底部放一塊玻璃板DNA。取出凝膠，切去邊緣多于部分，DNA遷移的距離

3、）。45分鐘，并溫和地不斷振蕩，使凝膠上的45分鐘，將凝膠中和至中性。（或一塊海綿）使盛器內(nèi)的板表面，在玻板表面蓋一張3mm的二號(hào)濾紙，濾紙兩邊浸沒于EB染色，在紫外燈下照防止凝膠的堿性破壞硝酸ds-DNA轉(zhuǎn)20倍SSC轉(zhuǎn)移濾液低于玻20倍SSC溶液中，在玻璃和濾紙之間，趕掉所有的氣泡。5.把凝膠底面朝上放在濾紙上，趕走兩層之間出現(xiàn)的氣泡。6.裁剪一張硝酸纖維膜，其長(zhǎng)與寬大于凝膠先把它放在去離子水中潤(rùn)濕后，再放在兩層之間不可有氣泡。i2mm,并在角上作記號(hào)，以確定濾膜方位。20倍SSC溶液中潤(rùn)濕5分鐘，然后放在凝膠表面，7.然后再把兩張與濾膜一樣大小的二號(hào)上，同樣要把氣泡趕走。濾紙，在2倍SS

4、C溶液中浸濕，覆蓋在硝酸纖維膜8.把一疊吸水紙(或衛(wèi)生紙，約有58cm高，略小于濾紙)，放置在濾紙上，在吸水紙上再放一塊玻璃板和重約500g的重物，放置過夜。9.轉(zhuǎn)移結(jié)束后，移去上面的吸水紙和濾紙，同時(shí)翻轉(zhuǎn)取出凝膠與硝酸纖維膜，把凝膠的點(diǎn)樣與硝酸纖維膜的相對(duì)應(yīng)位置用鉛筆或解剖針的針尖做好標(biāo)記。11.把已轉(zhuǎn)移了DNA的硝酸纖維膜放在6倍SSC溶液中振蕩浸泡5分鐘，然后放在濾紙上吸干溶液。再把它夾在兩層濾紙之間,80真空干燥2小時(shí)。注意事項(xiàng)將凝膠中和至中性時(shí)，要測(cè)pH,防止凝膠的堿性破壞硝酸纖維膜。要注意趕走凝膠和濾紙及硝酸纖維素膜之間的氣泡。Southern雜交簡(jiǎn)介：Southern雜交是分子生

5、物學(xué)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法。其基本原理是將待檢測(cè)的DNA樣品固定在固相載體上，與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交，在與探針有同源序列的固相DNA的位置上顯示出雜PCR產(chǎn)物判斷等研究中。Southern雜交。DNA樣品中是否有與探針同源的片段以及該交信號(hào)。通過Southern雜交可以判斷被檢測(cè)的片段的長(zhǎng)度。該項(xiàng)技術(shù)廣泛被應(yīng)用在遺傳病檢測(cè)、DNA指紋分析和但由于該技術(shù)的操作比較煩瑣、費(fèi)時(shí)，所以現(xiàn)在有一些其他的方法可以代替但該技術(shù)也有它的獨(dú)特之處，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多態(tài)性(RFLP)的檢測(cè)等。一、基因組DNA的制備二、基因組DNA的限制酶切根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定酶切DNA的量。一般Souther

6、n雜交每一個(gè)電泳通道需要10-30pg的DNA。購買的限制性內(nèi)切酶都附有相對(duì)應(yīng)的10倍濃度緩沖液，并可從該公司的產(chǎn)品目錄上查到最佳消化溫度。為保證消化完全，一般用24U的酶消化1pg的DNA。消化的DNA濃度不宜太高，濾紙，以0.5pg/pl為好。由于內(nèi)切酶是保存在50%甘油內(nèi)的，而酶只有在甘油濃度5%的條件下才能發(fā)揮正常作用，所以加入反應(yīng)體系的酶體積不能超過1/10。DNA(1pg/pl)20pg10H酶切buffer4.0pl具體操作如下：在1.5ml離心管中依次加入限制性內(nèi)切叮10U/p1)5.0pl加ddH20至50p1在最適溫度下消化1-3hr。消化結(jié)束時(shí)可取5p1電泳檢測(cè)消化效果。

7、如果消化效果不好，可以延長(zhǎng)消化時(shí)間，但超過6hr已沒有必要?；蛘叻糯蠓磻?yīng)體積，或者補(bǔ)充酶再消化。如仍不能奏效，可能的原因是DNA樣品中有太多的雜質(zhì)，或酶的活力下降。消化后的DNA加入1/10體積的0.5MEDTA，以終止消化。然后用等體積酚抽提、等體積氯仿抽提，2.5倍體積乙醇沉淀，少量TE溶解（參見DNA提取方法，但離心轉(zhuǎn)速要提高到12000g,以防止小片段DNA的丟失）。如果需要兩種酶消化DNA，而兩種酶的反應(yīng)條件可以一致，則兩種酶可同時(shí)進(jìn)行消化；如果反應(yīng)條件不一致，子強(qiáng)度，再加第二種酶進(jìn)行消化。則先用需要低離子強(qiáng)度的酶消化，然后補(bǔ)加鹽類等物質(zhì)調(diào)高反應(yīng)體系的離三、基因組DNA消化產(chǎn)物的瓊脂

8、糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是目前分離核酸片段最常用的方法，制備簡(jiǎn)單，分離范圍廣（200bp-50kb），實(shí)驗(yàn)成本低。下表列舉了不同濃度瓊脂糖凝膠能分離的DNA片段范圍。表：不同濃度瓊脂糖凝膠分離DNA片段的范圍瓊脂糖凝膠濃度（%）分離DNA片段范圍（kb）0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-32.00.1-21.制備0.8%凝膠：一般用于SouthernDOODODO0.8%。DNAMarker。2.DO：電泳樣品中加入6DLoading緩沖液，混勻后上樣，留一或兩泳道加l-2V/cm,DNA從負(fù)極O向正極。電泳至溴酚藍(lán)指示劑接近凝膠另一端

9、時(shí)，停止DO。取出凝膠，紫外燈下觀察電泳效果。在膠的一邊放置一把刻度尺，拍攝照片。正常電泳圖譜呈現(xiàn)DNA長(zhǎng)度。一連續(xù)的涂抹帶，照片攝入刻度尺是為了以后判斷信號(hào)帶的位置，以確定被雜交的四、DNA從瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物DNA。真空法和電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移就是將瓊脂糖凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜卩NC膜）或尼龍膜上，形成固相轉(zhuǎn)移的目的是使固相DNA與液相的探針進(jìn)行雜交。常用的轉(zhuǎn)移方法有鹽橋法、移法。這里介紹經(jīng)典的鹽橋法（又稱為毛細(xì)管法）。（一）試劑準(zhǔn)備叮變性液：0.5MNaOH；1.5MNaClD叮中和液：0.5MTris-HCl（pH7.4）；1.5MNaCl;7.0，加ddH2ODDDOOD20DS

10、SCD：NaCl175.3g;檸檬酸三鈉82.2g,NaOH調(diào)pH至至1000ml。（二）操作步驟1.堿變性:室溫下將凝膠浸入數(shù)倍體積的變性液中30min。2.中和:將凝膠轉(zhuǎn)移到中和液15min。3轉(zhuǎn)移按凝膠的大小剪裁NC膜或尼龍膜并剪去一角作為標(biāo)記，水浸濕后，浸入轉(zhuǎn)移液中5min。剪一張比膜稍寬的長(zhǎng)條Whatman3mm濾紙作為鹽橋，再按凝膠的尺寸剪大量的紙巾備用。按下圖所示進(jìn)行轉(zhuǎn)移。（轉(zhuǎn)移過程一般需要8-24hr,每隔數(shù)3-5張濾紙和hr換掉已經(jīng)濕掉的紙巾。轉(zhuǎn)移液用20DSSCD注意在膜與膠之間不能有氣泡。整個(gè)操作過程中要防止膜上沾染其他污物。）4.轉(zhuǎn)移結(jié)束后取出NC膜，浸入60SSC溶液

11、數(shù)min,洗去膜上沾染的凝膠顆粒，置于兩張濾紙之間，80C烘2hr,然后將NC膜夾在兩層濾紙間，保存于干燥處。五、探針標(biāo)記進(jìn)行Southern雜交的探針一般用放射性物質(zhì)標(biāo)記或用地高辛標(biāo)記。放射性標(biāo)記靈敏度高棉紗，效果好；地高辛標(biāo)記沒有半衰期，安全性好。這里介紹放射性標(biāo)記。探針的標(biāo)記方法有隨機(jī)引物法、很簡(jiǎn)單。切口平移法和末端標(biāo)記法，有一些試劑盒可供選擇，操作也以下為Promega公司隨機(jī)引物試劑盒提供的標(biāo)記步驟：取25-50ng模板DNA于0.5ml離心管中,100叮性2在另一個(gè)0.5ml離心管中加入：5min,立即置冰浴。Labeling5Dbuffer10|jl（含有隨機(jī)引物）dNTPmix

12、2jl（含dCTP、dGTP、dTTP各0.5mM）BSA（小牛血清白蛋白）2jla-32PdATP3jlKlenow酶5U3叮變性模板DNA加入0000,0ddH20至50jl,混勻。室溫或37卩1hr。4加50jl終止緩沖液終止反應(yīng)。標(biāo)記后的探針可以直接使用或過柱純化后使用。由于好的探針應(yīng)盡快使用。探針的比活性最好大于六、雜交a-32P的半衰期只有109計(jì)數(shù)/分/jl。14天,所以標(biāo)記即探針為液相,被雜交DNA為固相。雜交發(fā)生Southern雜交一般采取的是液-固雜交方式,于一定條件的溶液（雜交液）中并需要一定的溫度,可以用雜交瓶或雜交袋并使液體不斷的在膜上流動(dòng)。雜交液可以自制或從公司購買

13、,不同的雜交液配方相差較大,雜交溫度也不同。下面給出的為一雜交液配方：PEG600010%；SDS0.5%；6DSSC；50%甲酰胺。該雜交液的雜交溫度為42DD1預(yù)雜交NC膜浸入2DSSC05min,在雜交瓶中加入雜交液（8CmD8Cm的膜加5ml即可），將膜的背面貼緊雜交瓶壁，正面朝向雜交液。放入42雜交爐中，使雜交體系升到42。取經(jīng)超聲粉碎的鮭魚精DNA已溶解在水或TE0D100D0DD05min,迅速加到雜交瓶0,使其濃度達(dá)到100jg/ml。繼續(xù)雜交4hr。鮭魚精DNA的作用是封閉NC膜上沒有DNA轉(zhuǎn)移的位點(diǎn)，降低雜交背景、提高雜交特異性。2雜交倒出預(yù)雜交的雜交液，換入等量新的已升溫

14、至42的雜交液，同樣加入變性的鮭魚精DNA。將探針100叮熱5min,使其變性，迅速加到雜交瓶中。42卩雜交過夜。七、洗膜與檢測(cè)取出NC膜，在2DSSC溶液中漂洗5min,然后按照下列條件洗膜：2DSSC/0.1%SDS,42D,10min；1DSSC/0.1%SDS,42D,10min；0.5DSSC/0.1%SDS,42D,10min；0.2DSSC/0.1%SDS,56D,10min；0.1DSSC/0.1%SDS,56D,10min。在洗膜的過程中，不斷振搖，不斷用放射性檢測(cè)儀探測(cè)膜上的放射強(qiáng)度。實(shí)踐證明，當(dāng)放射強(qiáng)度指示數(shù)值較環(huán)境背景高1-2倍時(shí)，是洗膜的終止點(diǎn)。上述洗膜過程無論在哪一

15、步達(dá)到終點(diǎn)，都必須停止洗膜。洗完的膜浸入2DSSC中2min,取出膜，用濾紙吸干膜表面的水份，NC膜之間不能有氣泡。將膜正面向上，放入暗盒中（加雙并用保鮮膜包裹，注意保鮮膜與側(cè)增感屏），在暗室的紅光下，貼覆兩張X光片，每一片都用透明膠帶固定，合上暗盒，置-70低溫冰箱中曝光。根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱決定曝光時(shí)間，一般在1-3天時(shí)間。洗片時(shí)，先洗一張X光片，若感光偏弱，則再多加兩天曝光時(shí)間，再洗第二張片子。影響Southern雜交實(shí)驗(yàn)的因素很多，主要有：DNA純度、酶切效率、電泳分離效果、轉(zhuǎn)移效率、探針比活性和洗膜終止點(diǎn)等。七、注意事項(xiàng)1.要取得好的轉(zhuǎn)移和雜交效果，應(yīng)根據(jù)DNA分子的大小，適當(dāng)調(diào)整變性時(shí)間。

16、對(duì)于分子量較大的DNA片段（大于15kb），可在變性前用0.2MHCl預(yù)處理10min使其脫嘌呤。2.轉(zhuǎn)移用的NC膜，否則影響DNA的轉(zhuǎn)移及與膜的結(jié)合。3.轉(zhuǎn)移時(shí)，凝膠的四周用Parafilm蠟?zāi)し鈬?yán)，防止在轉(zhuǎn)移過程中產(chǎn)生短路，影響轉(zhuǎn)移效率，同時(shí)注意NC膜與凝膠及濾紙間不能留有氣泡，以免影響轉(zhuǎn)移。NC膜要預(yù)先在雙蒸水中浸泡使其濕透，否則會(huì)影響轉(zhuǎn)膜效果；不可用手觸摸4.注意同位素的安全使用?；蚪MDNASouthern雜交12裁三張大小合適的3MM濾紙，用20DSSC浸濕后鋪在濾膜表面。1）基因組DNASouthern印跡的制備預(yù)備1用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化基因組DNADOD10pg）。2進(jìn)行瓊

17、脂糖凝膠電泳。一般用0.7卩1.0卩的瓊脂糖凝膠分離基因組DNA,它在1D15kb的范圍內(nèi)有較好的分辨率，可選用TBE或TAE緩沖液。瓊脂糖凝膠電泳需在1V/cm的電壓下進(jìn)行，屏風(fēng)，如果要分離片段大小相似的DNA帶，應(yīng)用較大的凝膠D20D25cm）。常用的標(biāo)準(zhǔn)品是由Hind叮化的入DNA、Hae?；腦174DNA和100或1000bp的梯形圖譜。電泳完畢，將凝膠放在紫外透射儀上，并在凝膠旁放一尺子進(jìn)行拍照。當(dāng)把凝膠從盤內(nèi)移動(dòng)紫外透射儀時(shí)，小心不要將凝膠滑落或弄破。Southern印跡的制備1將凝膠轉(zhuǎn)移至塑料盒內(nèi)。2叮入至少4倍凝膠體積的0.25mol/LHCl使DNA脫嘌呤，置室溫?fù)u床溫育1

18、5min。這時(shí)凝膠上樣緩沖液中的溴酚藍(lán)應(yīng)變黃色，如果15min后仍呈藍(lán)色，應(yīng)再溫育5min。3小心地塑料盒內(nèi)HCl棄去，用蒸餾水漂洗凝膠一次。4加入至少4倍體積的變性緩沖液，置室溫?fù)u床溫育20min。5用新鮮緩沖液重復(fù)步驟4，小心棄去變性緩沖液，用蒸餾水稍加漂洗。6加入至少4倍體積的中和反應(yīng)緩沖液，置室溫?fù)u床溫育15min。7用新鮮緩沖液重復(fù)步驟6。8當(dāng)處理凝膠時(shí)，裁一張略大于凝膠的濾膜（硝酸纖維膜或尼龍膜），預(yù)先用蒸餾水將濾膜浸濕后用20DSSC浸泡至少15min。9叮裝轉(zhuǎn)移裝置。在盤中加入印跡緩沖液（20DSSC）,在緩沖液面作一平臺(tái)，比如可倒置一凝膠盤，上面蓋三張經(jīng)20DSSC飽和過的濾

19、紙（Whatman3MM）,平臺(tái)兩側(cè)的濾紙應(yīng)浸泡在緩沖液中，用10ml的玻璃吸管在其表面小心滾動(dòng)以趕出所有氣泡，并將濾紙推平。10D倒數(shù)毫升20DSSC于濾紙表面，將凝膠面向下倒扣在濾紙上，小心趕出凝膠與濾紙間的氣泡，凝膠四周用膠布或塑料薄膜包裹以防緩沖液從凝膠周圍直接流至紙中（虹吸短路）。11叮數(shù)ml20DSSC浸沒凝膠，表面覆以濾膜，確保凝膠與濾膜之間無氣泡。13放一疊干燥的吸水紙（印跡紙或紙巾）在3MM濾紙上（約5D8cmODD14置一玻璃板于吸水紙上，其上放一重約0.75卩1kg的物體。20DSSCD1D3LDD濾紙上，凝膠115卩DNA轉(zhuǎn)移可進(jìn)行12D16h（如過夜D,確保槽內(nèi)有足夠

20、的16毛細(xì)管虹吸轉(zhuǎn)移完畢，小心拆卸印跡裝置。將膜與凝膠一起轉(zhuǎn)移至干燥的在上，用軟鉛筆標(biāo)記凝膠和濾膜的加樣孔位置，撕去凝膠。17D05DSSC漂洗雜交膜以去除瓊脂糖殘跡。18叮濾膜放在一張干燥的3MM濾紙上稍微晾干。19D00DNA于濾膜上，若用硝酸纖維素膜，在80卩真空箱中烤2h；若用尼龍膜，將DNA面朝下暴露于紫外透射儀3D5minD20卩這時(shí)的濾膜已可用于雜交，或貯存在4。硝酸纖維素膜需真空保存，尼龍膜需用塑料薄膜密封。2DDNA印跡雜交1D05DSSPE浸滲DNA濾膜。2將浸濕的DNA濾膜放入塑料袋內(nèi)，袋的四邊密封并剪去一角。3從缺口處加入預(yù)雜交液（0.1ml/cm2D，避免加入氣泡，將袋中的氣泡全部擠出，封口。4叮塑料袋置水浴搖床中溫育，或夾在兩塊玻璃板中置65DD02D4小時(shí)，確保濾膜表面無氣泡。5D095D10min使探針變性，立即置冰浴冷卻