DNA的復制幻燈片

1、第四章 DNA的復制 Chapter 4 DNA Replication第四章 DNA 復 制DNA Replication1 引言-基因組復制與細胞分裂的關系2 復制子3 DNA復制的幾種形式4 DNA聚合酶5 原核生物DNA復制的基本過程6 真核生物DNA復制7 DNA復制的調(diào)控8 小 結重點內(nèi)容： 幾個重要概念：DNA的復制、復制子、復制眼、復制叉、DNA聚合酶、DNA的半保留復制、DNA的半不連續(xù)復制、DNA的先導鏈、DNA的后隨鏈、岡崎片段；不同生物基因組復制子數(shù)目；線性DNA復制末端問題的提出及解決方案；-復制、滾環(huán)復制及D-環(huán)復制的機制；大腸桿菌DNA聚合酶 I、II、 III

2、的性質(zhì)比較，DNA聚合酶與缺口平移法制備探針；DNA復制的起始、延伸及終止。了解內(nèi)容： 基因組復制與細胞分裂的關系；復制叉移動方向的確定；真核生物DNA聚合酶的種類及各自的功能；DNA復制的調(diào)控。 1 引言-基因組復制與細胞分裂的關系 細胞在每次分裂的過程中，整個基因組都必須精確地復制一次。 如何保證這一點？兩個原則 (1) DNA復制的啟動決定了細胞的進一步分裂; (2) 復制過程完成前，細胞是不會發(fā)生分裂的。2 復制子(replicon)2.1 復制子的定義2.2 不同生物復制子的數(shù)目2.3 復制眼概念2.4 復制叉概念及其移動方向的實驗確定2.5 復制的模式-起點、方向和速度2.1 復制

3、子的定義DNA中發(fā)生一次復制的單位稱為復制子(replicon) 。 復制子是根據(jù)它含有復制所需的控制元件來定義的，在復制啟動位點具起始點（origin)，在復制終止位點具終點（terminus)。起始點僅作用于所在復制子。 注：在每個細胞周期中，每個復制子發(fā)生一次復制，且只發(fā)生一次。質(zhì)粒一般是一個自主環(huán)狀的DNA基因組，構成一個獨立復制子；原核生物基因組中一般只含一個復制子，在唯一的起始點啟動就會引起整個基因組復制；真核生物基因組含多個復制子（一般40-100kb/個）。 2.2 不同生物復制子的數(shù)目2.3 復制眼概念 復制眼：在一個長的未復制區(qū)域內(nèi)DNA已經(jīng)復制的區(qū)域Replication

4、 eye復制叉:雙螺旋DNA兩條親本鏈分開使復制能進行的部位。2.4 復制叉的概念及其移動方向的確定復制叉移動方向的確定放射性自顯影法：對于大基因組內(nèi)的不確定區(qū)域，兩次連續(xù)的放射脈沖可以用來標記復制的移動。如果一個脈沖比另一個脈沖強，我們可以用相對的標記強度來區(qū)分，這些可用放射自顯影觀察。單向復制：在復制眼的一端，一種類型的標記后緊跟著另一種標記；雙向復制：在復制眼的兩端產(chǎn)生一種（對稱的）模式。在真核生物中普遍存在。2.5 復制的模式-起點、方向和速度單起點、單方向多起點、單方向單起點、雙方向多起點、雙方向3 DNA復制的幾種形式3.1 線性DNA雙鏈的復制3.2 環(huán)狀DNA雙鏈的復制 3.1

5、 線性DNA雙鏈的復制3.1.1 線性DNA復制的具體表現(xiàn)3.1.2 線性DNA復制時末端問題的提出3.1.3 線性DNA復制時末端問題的解決方案3.1.1 線性DNA復制的具體表現(xiàn) 3.1.2 線性DNA復制時末端問題的提出 所有已知的核酸聚合酶，無論是DNA聚合酶還是RNA聚合聚合酶都只從5端向3端移動，新鏈的合成方向與聚合酶移動方向一致，即只能是5 3； 而對于DNA的合成必需一段引物的存在，體內(nèi)DNA復制時，由一段RNA引物起始DNA合成，起始后它必須切除，切除后，5端如何起始呢？ 這就提出了線性DNA末端復制的問題。復制能在新合成鏈的3端結束，它如何在5端啟動呢？ 3.1.3 線性D

6、NA復制時末端問題的解決方案(1）通過將線性復制子轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀或多聚分子。如噬菌體：滾環(huán)產(chǎn)生多聚復制子）；(2）某種蛋白質(zhì)可能會介入，在真正的末端上啟動。幾種線性病毒核酸具有與5端堿基共價結合的蛋白質(zhì)，其中了解最清楚的例子是腺病毒 DNA )。(3）DNA可形成特殊的結構，如在末端形成發(fā)夾。使分子沒有游離末端。草履蟲（Paramecium）的線性線粒體DNA的復制中就形成了一種交聯(lián)；(4）末端是可變的，而不是精確確定的。真核生物染色體可能采用這種方式，在這種情況下，DNA末端的短重復序列的拷貝數(shù)改變（如端粒的復制）；（1）通過將線性復制子轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)狀或多聚分子The rolling circle

7、replicates DNAPhage A rolling circle appears as a circular molecule with a linear tail by electron microscopy. Adenovirus terminal protein binds to the 5 end of DNA and provides a C-OH end to prime synthesis of a new DNA strand.（2） 某種蛋白質(zhì)介入而在真正的末端啟動復制Adenovirus DNA replication is initiated separately

8、 at the two ends of the molecule and proceeds by strand displacement. （3）DNA末端形成特殊結構A typical telomere has a simple repeating structure with a G-T-rich strand that extends beyond the C-A-rich strand. The G-tail is generated by a limited degradation of the C-A-rich strand.（4） 末端長度可變A loop forms at th

9、e end of chromosomal DNA.The 3 single-stranded end of the telomere (TTAGGG)n displaces the homologous repeats from duplex DNA to form a t-loop. Watching flash3. 2 環(huán)狀DNA的復制3.2.1 -復制3.2.2 滾環(huán)復制3.2.3 D-環(huán)復制3.2.1 -復制 replication by -structure3.2.2 滾環(huán)復制replication by rolling cycles structureX174噬菌體由一個單鏈環(huán)狀D

10、NA組成，這條鏈稱為正（+）鏈；合成的互補鏈稱為負（一）鏈。雙鏈體的復制以滾環(huán)復制方式進行。The A protein is cis-actingPhage X174The replication by rolling cycle structure3.2.3 D-環(huán)復制Replication by displacement loop structureD-環(huán)復制（Replication by displacement loop structure)4 DNA聚合酶4.1 大腸桿菌DNA聚合酶的種類及其功能4.2 真核生物DNA聚合酶的種類及其功能4.3 DNA聚合酶所具有的共同結構4.1 大

11、腸桿菌DNA聚合酶的種類及其功能SOS 修復性 質(zhì)聚合酶I聚合酶II聚合酶III35外切+5 3外切+-新生鏈的合成-+生物學活性10.0515生物學功能切除引物修復DNA修復DNA復 制4.1.1 大腸桿菌DNA聚合酶 I、II、 III 的性質(zhì)比較（1）DNA聚合酶 I 103 kDa的單鏈多肽，可以被蛋白酶切成兩段，C端的2/3包括聚合酶活性位點；N端的1/3包含核酸外切酶校正活性（一次可切除1-10個堿基）。（2） 利用DNA聚合酶 I 進行缺口平移法制備探針的基本原理4.1.2 DNA聚合酶 I 與缺口平移法制備探針Nick translation replaces part of

12、a pre-existing strand of duplex DNA with newly synthesized material. DNase 4.2 真核生物DNA聚合酶的種類及其功能真核生物由不同DNA聚合酶分別負責起始和延伸三種細胞核DNA復制酶具有不同的功能: DNA polymerase 起始新鏈合成DNA polymerase 延伸先導鏈DNA polymerase 可能與后隨鏈合成有關，也可能具有其他功能 4.3 DNA聚合酶所具有的共同結構許多DNA聚合酶有一個由三個結構域組成的大裂隙，類似于手形。The common organization of DNA polyme

13、rases has a palm that contains the catalytic site, fingers that position the template, a thumb that binds DNA and is important in processivity, an exonuclease domain with its own active site, and an N-terminal domain.5 原核生物DNA復制的基本過程5.1 DNA復制的起始5.2 DNA合成鏈的延伸5.3 DNA復制的終止5.1.1 單鏈DNA的產(chǎn)生5.1.2 3-OH引發(fā)末端的產(chǎn)

14、生5.1.3 復制復合體的形成 5.1 DNA復制的起始5.1.1 單鏈DNA的產(chǎn)生解旋酶(helicase): 使DNA的兩條鏈分開，它通常利用ATP水解來提供必需的能量；拓撲異構酶 （DNA Topisomerase ）拓撲異構酶的種類分為型和型。原核拓撲構酶： MW=100kD，單肽鏈，含34個Zn。 作用是暫時切斷一條DNA鏈，形成酶-DNA共價中間物而使超螺旋DNA松弛，然后再將切斷的單鏈DNA連接起來。每次改變一個連環(huán)數(shù)。原核拓撲構酶作用機制：酶與DNA結合使雙鏈解旋；使一條鏈切開，但酶與切口的兩端結合阻止了螺旋的旋轉(zhuǎn)；酶使另一條鏈經(jīng)過缺口，然后再將兩斷端連接起來；酶從DNA上脫落

15、，兩條鏈復原，得到的DNA比原來少一個負超螺旋。拓撲異構酶 拓撲異構酶也稱旋轉(zhuǎn)酶。廣泛存在于各種生物中。 使正超螺旋轉(zhuǎn)化為負超螺旋，每次改變兩個連接數(shù)。Replication machineryreplicationPositive supercoilBreak DNATopoisomerase IIpass DNA through the breaknegative supercoil單鏈結合蛋白（single-strand binding protein):單鏈DNA結合，阻止其再形成雙鏈體狀態(tài)X174 噬菌體的DNA在三種功能蛋白先后作用下分開成為單鏈：在復制起始點，噬菌體A蛋白使病毒（

16、+）鏈產(chǎn)生缺口。Rep蛋白提供解旋酶活性，它使兩鏈分離。SSB包繞單鏈形成穩(wěn)定的單鏈形式。Three proteins unwind X174 DNA5.1.2 3-OH引發(fā)末端的產(chǎn)生多種方法可以產(chǎn)生3-OH末端1)3)2)起始需要解旋酶、單鏈結合蛋白和引發(fā)酶5.1.3 復制復合體的形成5.2 DNA合成鏈的延伸5.2.1 半保留復制合成兩條新的DNA鏈5.2.2 DNA的合成是半不連續(xù)的5.2.3 連接酶將岡崎片段連接在一起5.2.4 前導鏈和后隨鏈的協(xié)調(diào)合成 5.2.5 DNA復制忠實性的控制 (1) 半保留復制的概念 DNA在復制時，兩條鏈解開分別作為模板，在DNA聚合酶的催化下按堿基互

17、補的原則合成兩條與模板鏈互補的新鏈，以組成新的DNA分子。這樣新形成的兩個DNA分子與親代DNA分子的堿基順序完全一樣。由于子代DNA分子中一條鏈來自親代，另一條鏈是新合成的，這種復制方式稱為半保留復制 (semiconsertive replication)。5.2.1 半保留復制合成兩條新的DNA鏈(2)半保留復制實驗證據(jù)（Meselson-Stahl) 1958年Meselson & stahl用同位素（15N）示蹤標記加密度梯度離心技術實驗,該實驗跟蹤了生長了三代的大腸桿菌，證明了DNA是采取半保留的方式進行復制。15N15N-14N14N15N-14N15N-14N5.2.2 DNA

18、的合成是半不連續(xù)的（semidiscontinuous replication)DNA 復制在合成先導鏈（leading strand) 時是連續(xù)的；而在合成后隨鏈(lagging strand)時是先形成小片段（ Okazaki fragment ），隨后再將它們連接而成大片段。因后隨鏈是不連續(xù)合成的而先導鏈是連續(xù)合成的，所以我們稱之為半不連續(xù)復制（semidiscontinuous replication)。兩條新鏈具有不同的特征The two new DNA strands have different featuresOkazaki fragment5.2.3 連接酶（Ligase)將Okazaki fragment連接在一起5.2.4 前導鏈(Leading strand)和后隨鏈(lagging strand)的協(xié)調(diào)合成5.2.5 DNA聚合酶控制復制的忠實性DNA聚合酶造成的復制錯誤可分為兩類：移碼（frameshift): 指一個核苷酸的插入或缺失。替換（substitutio