高中生物 微生物的選擇培養(yǎng)與計(jì)數(shù) 課件

1、微生物的選擇培養(yǎng)與計(jì)數(shù)深圳市光明區(qū)高級(jí)中學(xué)朱鏡如課題背景 自然界中微生物數(shù)量繁多，種類龐雜，要想從中分離出需要的特定微生物并不容易，尤其當(dāng)要分離的微生物在混合菌群中不是優(yōu)勢(shì)種群時(shí)，更難實(shí)現(xiàn)。稀釋涂布平板法呈現(xiàn)的雜菌群那么我們又如何達(dá)成這一目標(biāo)呢？科學(xué)家們應(yīng)用選擇性培養(yǎng)基解決了這一難題。1. 科學(xué)實(shí)例：尋找耐高溫的DNA聚合酶啟示：尋找目的菌種時(shí)要根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。篩選原因：因?yàn)闊崛母邷貤l件淘汰了絕大多數(shù)微生物，使耐熱的Taq細(xì)菌保留下來。PCR是一種在體外DNA復(fù)制的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。1966年，布魯克在美國黃石國家公園的一個(gè)

2、熱泉中發(fā)現(xiàn)了耐熱的Taq細(xì)菌，并分離到耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）。（一）選擇培養(yǎng)基耐高溫的酶耐高溫生物體高溫環(huán)境（熱泉、火山口）尋找尋找培養(yǎng)基中加氨芐青霉素具有氨芐青霉素抗性的菌落沒有氨芐青霉素抗性的細(xì)菌培養(yǎng)基應(yīng)有菌落沒有氨芐青霉素抗性的細(xì)菌被淘汰怎樣選擇出抗氨芐青霉素能力的細(xì)菌?舉例2.實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長。（一）選擇培養(yǎng)基允許特定種類的微生物生長，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基，叫做選擇培養(yǎng)基。不加有機(jī)碳源 不加氮源3.選擇培養(yǎng)基舉例自養(yǎng)微生物酵母菌和霉菌(青霉素能殺死細(xì)菌、放線菌

3、)固氮微生物加入青霉素加高濃度食鹽金黃色葡萄球菌石油是唯一碳源（一）選擇培養(yǎng)基能消除石油污染的微生物思考-討論選擇培養(yǎng)基配方的設(shè)計(jì)尿素的立體結(jié)構(gòu) 尿素CO(NH2)2含氮量高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種重要的氮肥。尿素被土壤中某些細(xì)菌分解成NH3,再被轉(zhuǎn)化為NO3-、NH4+等被植物吸收。 這些細(xì)菌之所以能分解尿素，是因?yàn)槟芎铣呻迕?，來催化尿素分解。討論?.你如何設(shè)計(jì)培養(yǎng)基配方，將土壤稀釋液中能分解尿素的細(xì)菌分離出來？2.該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基有哪些共同點(diǎn)和不同點(diǎn)？培養(yǎng)基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素、缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖

4、，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。見P18頁培養(yǎng)基配方1.從物理性質(zhì)來講，兩者屬于_培養(yǎng)基， 判斷依據(jù)是_； 該類培養(yǎng)基的主要用途為_；2.從用途上來講，培養(yǎng)基二屬于_培養(yǎng)基， 目的是為了獲得_；3.兩種培養(yǎng)基共有的培養(yǎng)基成分有：_； 培養(yǎng)基一的碳源為_，氮源為_； 培養(yǎng)基二的碳源為_，氮源為_。培養(yǎng)基一牛肉膏5.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g瓊脂20.0g蒸餾水定容到1000ml培養(yǎng)基二KH2PO41.4gNaH2PO42.1gMgSO47H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素CO(NH2)21.0g瓊脂15.0g蒸餾水定容到1000ml固體添加了凝固劑瓊脂，且比例為1.5%2

5、%分離、鑒定、計(jì)數(shù)選擇能分解尿素的微生物碳源、氮源、無機(jī)鹽、水牛肉膏蛋白胨葡萄糖尿素討論：稀釋涂布平板法1.原理：將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。稀釋度足夠高時(shí)，能在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)菌落。（二）微生物的選擇培養(yǎng) 如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的細(xì)菌，還需對(duì)土壤菌液進(jìn)行稀釋及科學(xué)的微生物數(shù)量測(cè)定方法-稀釋涂布平板法。6支試管，分別加入9ml無菌水1ml1021ml1031ml1041ml1051ml1061ml1072.樣品梯度稀釋：微量 移液器稀釋10倍菌液101土壤10g 在火焰旁稱取土壤10g，加入90ml無菌水中，搖勻，

6、制成稀釋10倍的土壤菌液。分別取1ml上清液，加入盛有9ml無菌水的試管中，制成不同稀釋倍數(shù)的菌液。取6支試管，分別加入9ml無菌水。灼將涂布器在火焰上灼燒，待酒精燃盡后，涂布器冷卻后，再進(jìn)行涂布。涂用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使涂布均勻。各梯度分別涂布3個(gè)平板1個(gè)不涂布作空白對(duì)照3.取樣涂布平板：滴取0.1ml菌液（不超過 ），滴加到培養(yǎng)基表面 將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中 浸放入37恒溫箱中培養(yǎng)12d4.培養(yǎng)與觀察稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍空白對(duì)照恒溫培養(yǎng)箱（三）微生物的數(shù)量測(cè)定稀釋涂布平板法除用于分離微生物外，也常用于統(tǒng)計(jì)樣品中活菌數(shù)。在稀釋度足夠

7、高時(shí)，培養(yǎng)基上表面生長的一個(gè)單菌落來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌，通過統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，可推測(cè)出樣品中大約有多少活菌。1)原理：2)計(jì)數(shù)原則：一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。1.稀釋涂布平板法：注意事項(xiàng)為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。為增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)說服力與準(zhǔn)確性，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要涂布至少三個(gè)平板作為重復(fù)組。（重復(fù)實(shí)驗(yàn)，減少誤差）。統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。因此，統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)表示。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，要考慮重復(fù)組結(jié)果是否接近，如果相差太大，意味著操作有誤，需重新實(shí)驗(yàn)。因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，繁殖后形成的還是一個(gè)菌落實(shí)例分析：甲

8、同學(xué)做此實(shí)驗(yàn)在稀釋倍數(shù)105獲得3個(gè)平板，菌落數(shù)分別是80、90、100，涂布平板時(shí)均使用0.1ml菌液，試計(jì)算每克土壤中可以分離尿素的細(xì)菌數(shù)目？3)計(jì)算：每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。（80+90+100）/30.1 105 =9 107個(gè)2.顯微鏡直接計(jì)數(shù)：這種方法是利用特定細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)每小格平均細(xì)菌數(shù)40010000稀釋倍數(shù)注意：統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般是活菌數(shù)和死菌數(shù)的總和。（“染色排除法”）探究-實(shí)踐(四）土壤中分

9、解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)尿素的立體結(jié)構(gòu)提出問題1.從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌 2.統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌研究思路土壤取樣制備培養(yǎng)基樣品稀釋與取樣涂布微生物的培養(yǎng)與觀察絕大多數(shù)微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出分解尿素的細(xì)菌?；A(chǔ)知識(shí)1.土壤取樣1）取樣的位置：土壤含有大量的微生物，是微生物的天然培養(yǎng)基。細(xì)菌適宜在酸堿度接近中性的 潮濕土壤中生長，絕大多數(shù)的細(xì)菌分布距地表38cm的土壤層。2）取樣要求：先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。 取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的

10、的信封在使用前都要滅菌。 2.制備培養(yǎng)基制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。3.樣品的稀釋測(cè)土壤中細(xì)菌數(shù)量，一般選用1x104 、1x105 和1x106倍的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)。4.微生物的培養(yǎng)與觀察30-370C溫度下培養(yǎng)1-2d，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)圖中的1、2、3平板是選擇培養(yǎng)基，4平板為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，以判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用；另外，還要有兩個(gè)對(duì)照，即不接種的選擇培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，以驗(yàn)證培養(yǎng)基中是否含有雜菌。4.微生物的培養(yǎng)與觀察 操作提示2）無菌操作3）做好標(biāo)記本實(shí)驗(yàn)使用的平板和試管比較多，為避免混淆，使用前要做好標(biāo)記4）制定計(jì)劃對(duì)于耗時(shí)較長的生物實(shí)驗(yàn)，要事先規(guī)劃時(shí)間，以便提高工作效率，在操作時(shí)更加有條不紊1）不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。a.取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。b.應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入 錐形瓶中，塞好棉塞。c.在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。主要方法平板劃線法稀