研究生課程-分子生物學-專題篇

1、3.專題篇第十九章基因診斷基因診斷：以DNA或RNA為診斷材料，通過檢查基因的存在，結(jié)構(gòu)缺陷或表達異常，對人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過程?；驹恚簷z測DNA或RNA的結(jié)構(gòu)變化與否、量的多少及表達功能是否正常， 確定受檢者是否存在基因水平的異常變化，以此作為疾病診斷的依據(jù)。意義：不僅能對疾病作出早期和確切診斷， 而且能確定個體對疾病的易感性及疾 病的分期、分型、療效監(jiān)測、預后判斷等。第一節(jié)基因診斷的技術(shù)方法常用的分子生物學技術(shù)（一）核酸分子雜交包括 Southern blot; Northern blot; dot blot; in situ hybridization 等（二）聚合酶鏈式

2、反應(yīng)（PCR）常與其他技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用（三）單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測（SSCP; single strand conformation polymorphism）是一種基于單鏈DNA構(gòu)象差別來檢測點突變的方法，常與 PCR聯(lián)用, 稱PCR-SSCP PCR產(chǎn)物變性后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，正?；蚝妥儺惢虻倪w移位置不同，借此可分析確定致病基因的存在。（四）限制酶酶譜分析限制性片段長度多態(tài)性（RFLP； restrict fraction length polymorphinsm） （五）DNA序列測定是進行基因突變檢測最直接、最準確的方法，不僅可確定突變的位置，而且可確定突變的性質(zhì)。（六）DNA芯片技

3、術(shù)實際上是一種快速、敏感、高效、自動化的核酸雜交技術(shù)基因診斷的基本方法特點：1:特異性強檢測特異性高達100%.早期診斷.靈敏度高檢測靈敏度達毫微微克（fg）水平.取樣方便任一有核細胞均可作為檢測樣品（一）基因突變的診斷1、點突變的診斷（1）已知的點突變可采用PCR/ASO （等位基因特異性寡核甘酸；allele specific oligonucleotide）探針法檢測。（2） 未知的突變PCR-SSCRDNA序列測定；DNA芯片技術(shù)；等2、少數(shù)核甘酸缺少或插入探針法3、大片段丟失或插入PCR; 多重PCR （因為常規(guī)PCR擴增2kb以上的片段比較困難）4、基因重排（染色體易位）PCR;

4、原位雜交（包括FISH）;5、基因擴增Southern blot （先用酶切，再作 blot）（二）多態(tài)性分析1、RFLP分析（1）限制酶酶譜直接分析法（2） RFLP間接分析法2、DNA重復序列多態(tài)性分析（三）基因表達異常的診斷1、mRNA相對定量分析(1)斑點或狹縫雜交(2) RT-PCR2、mRNA絕對定量分析RT-PCR魔爭性PCR3、mRNA長度分析Northern blot(四)外源DNA檢測血清學等方法不夠靈敏或特異，考慮用核酸分子雜交或PCR等技術(shù)，應(yīng)用基因特異性探針或合成特異的寡核甘酸引物來檢測。第二節(jié)月中瘤的基因診斷一、月中瘤基因診斷的策略1、檢測月中瘤相關(guān)基因2、檢測月中

5、瘤相關(guān)病毒的基因3、檢測月中瘤標志物基因或mRNA第二十章基因治療基因治療一般是指將限定的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入患者特定的靶細胞，以最終達到預防或改 變特殊疾病狀態(tài)為目的的治療方法。基因治療的主要策略基因置換 (gene replacemen城稱基因矯正 (gene correction)： 特定的目的 基因?qū)胩囟ǖ募毎?，通過定位重組，讓導入的正?；蛑脫Q基因組內(nèi)原 有的缺陷基因，不涉及基因組的任何改變。基因添加或稱基因增補(gene angmentation ：通過導入外源基因使靶細胞 表達其本身不表達的基因。基因干預(gene interference：采用特定的方式抑制某個基因的表達，或 者通過

6、破壞某個基因而使之不能表達，以達到治療疾病的目的?；蛑脫Q或基因添加的必要條件對導入的基因及其產(chǎn)物有詳盡的了解外來基因能有效地導入靶細胞導入基因能在靶細胞中長期穩(wěn)定駐留導入基因能有適度水平的表達基因?qū)氲姆椒八幂d體對宿主細胞安全無害導入自殺基因一一細胞自殺效應(yīng)將自殺基因轉(zhuǎn)移入宿主細胞中，該基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化 為細胞毒性代謝物，誘導靶細胞 自殺”，清除月中瘤細胞。基因修飾一一改變細胞功能基因修飾月中瘤細胞的 疫苗”療法基因修飾TIL的過繼免疫方法免疫增強基因療法原位修飾月中瘤免疫原性的基因療法基因標記(gene labeling)：基因標記實驗是基因治療的前奏，并不在于直

7、接治療疾病而是期望能夠提供有關(guān)正常細胞生物學和疾病病理方面的信 息。基因治療基本上涉及三步基因?qū)?administration)：把基因或把含有基因的載體導入機體?；騻鬟f(delivery):基因從導入部位進入靶細胞核?；虮磉_(expression：細胞中治療性基因產(chǎn)物的形成。理想的基因治療載體具備的性質(zhì)易于進入靶細胞。在特異細胞或組織達到有規(guī)律、充分及持續(xù)的外源基因表達。外源基因應(yīng)含或整合于基因組活化區(qū)內(nèi)或能自主復制的構(gòu)件。整個過程應(yīng)安全有效并具有選擇性。易于大量生產(chǎn)?；蛑委熭d體的選擇（考慮因素）靶細胞或靶組織疾病類型期望是否持續(xù)或短暫表達所要求的基因表達水平體內(nèi)或回體基因治療安全性

8、：風險效應(yīng)比。病毒載體具備的條件攜帶外源基因并能包裝成病毒顆粒介導外源基因的轉(zhuǎn)移和表達對機體不致病病毒載體類型重組型病毒載體：以完整的病毒基因組為改造對象，選擇性刪除病毒的某 些必需基因（早期基因、控制表達的基因），缺失的功能由互補細胞反式 提供；利用同源重組方法將適當長度的外源基因插入病毒基因組的非必需 區(qū)，不改變病毒復制和包裝所需的順式元件。無病毒基因的病毒載體：由載體質(zhì)粒和輔助系統(tǒng)組成。載體質(zhì)粒：由外源 基因表達盒、病毒復制和包裝所必需的順式作用元件及質(zhì)粒骨架組成； 輔 助系統(tǒng)：由病毒復制和包裝所必需的反式作用元件組成逆轉(zhuǎn)錄病毒載體優(yōu)點：高效地感染分裂的宿主細胞（100%）;在感染后，逆

9、轉(zhuǎn)錄病毒能夠 將前病毒基因組穩(wěn)定地整合到宿主基因組的隨機位點上；利用重組逆轉(zhuǎn)錄 病毒能將目的DNA傳遞給整個細胞群體；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可感染多種人 和動物的細胞，宿主范圍非常廣；不產(chǎn)生任何有免疫原性的病毒蛋白， 對 宿主細胞無毒性作用，可建立細胞系長期持續(xù)表達外源基因。缺點：只能整合至分裂相的細胞；容量?。ú怀?10kb）；病毒滴度不高； 由于其隨機整合，有激活癌基因的潛在危險。腺病毒載體優(yōu)點：轉(zhuǎn)染效率高、安全；宿主范圍廣，與細胞分裂無關(guān)；容量大，制備 較易，病毒滴度較高。缺點:不能整合到染色體，表達時間短暫（1-6周）;具有免疫原性；反復治療效 率降低;缺陷病毒可與宿主基因組或其它病毒發(fā)生重組

10、，產(chǎn)生危險系數(shù)高的 新病毒腺相關(guān)病毒優(yōu)點:是非病原微生物，未發(fā)現(xiàn)野生型AAV與人類疾病有關(guān)；它既能感染分 裂細胞，又能感染非分裂細胞；宿主范圍廣，能感染多種宿主細胞；插入突變 的危險性相當?shù)汀Ｈ秉c：只能包裝小于5kb的目的基因片段，相對轉(zhuǎn)基因能力受限；整合時 需要輔助病毒感染才能進行復制，增加包裝的難度；很難大量生產(chǎn)。單純皰疹病毒載體優(yōu)點：HSV載體能攜帶30-50kb的外源基因，可在多種細胞中復制；能感 染分裂和非分裂細胞，對神經(jīng)細胞易感。缺點：病毒不能整合入宿主細胞染色體，只能短暫表達；對感染的細胞產(chǎn) 生毒性作用?；蛑委煹姆遣《据d體非病毒方法是依賴細胞機制將 DNA導入細胞進而轉(zhuǎn)移至細胞

11、核。與病毒載體相比非病毒載體的優(yōu)點：對受轉(zhuǎn)移的DNA大小沒有限制；DNA 容易進行操作，對于包裝與復制需要的病毒序列沒有特殊要求；比構(gòu)建的病毒載體安全，不可能誘發(fā)任何感染；免疫源性問題少。理想的非病毒DNA傳遞系統(tǒng)應(yīng)具備的性質(zhì)：已知結(jié)構(gòu)及成分在生物液體中，傳遞系統(tǒng)的穩(wěn)定性受到復合物成分的控制細胞攝取受細胞特異性漿膜受體的控制能迅速從內(nèi)容泡中釋放(依賴于 pH值)能有效地脫包膜并經(jīng)細胞質(zhì)運輸 DNADNA的核攝取充分能達到所期望的持續(xù)表達核酶(ribozyme )RNA組成的酶可催化RNA切割和RNA剪接反應(yīng)。結(jié)構(gòu)：錘頭狀和發(fā)夾狀。具有催化RNA切割的核酶可作為基因表達和病毒復制的抑制劑，目前已

12、被開發(fā)用于基因治療。三鏈 DNA (triple-strand DNA )當某一 DNA或RNA寡核甘酸與DNA高喋吟區(qū)結(jié)合時可形成三鏈。三鏈形成寡核甘酸(triple-forming oligonucleotide , TFO)能特異地結(jié)合在DNA大溝中，并與富含喋吟鏈上的堿基形成 Hoogsteen氫鍵。TFO與靶DNA的結(jié)合具有高度序列特異性，這是三鏈DNA的應(yīng)用基礎(chǔ)。TFO的作用機制：基因調(diào)控區(qū)形成三鏈 DNA后抑制基因轉(zhuǎn)錄基因治療的疾病遺傳病的基因治療在DNA水平明確其發(fā)病原因及機制必須是單基因遺傳病，而且屬隱性遺傳該基因的表達不需要精確調(diào)控該基因能在一種便于臨床操作的組織細胞中表達

13、并發(fā)揮其生理作用該遺傳病不經(jīng)治療將有嚴重后果月中瘤基因治療基因干預技術(shù)：反義RNA; RNA干擾；反義基因自殺基因治療：免疫基因治療：細胞因子基因治療；MHC基因治療提高化療效果的輔助基因治療：藥物增敏；耐藥基因的相關(guān)治療聯(lián)合基因治療：自殺基因；免疫因子基因；抑癌基因；自殺基因與細胞因子基因；抑癌基因與免疫因子基因；病毒性疾病的基因治療誘導對病毒RNA的降解：抑制病毒與宿主細胞的結(jié)合：干擾病毒基因組的轉(zhuǎn)錄起始和調(diào)控：抑制病毒基因組的復制和蛋白質(zhì)合成：RNA干擾技術(shù)：基因治療的前景與問題基因治療中所用的各種啟動子，在不同種類的體細胞中表達效率是不同的。基因治療研究中，體外基因轉(zhuǎn)移是一個重要的研究

14、領(lǐng)域， 人體細胞在體外進行長期培養(yǎng)和繁殖，細胞的生物學改變是值得研究的問題。要有效和簡便地將基因治療應(yīng)用于臨床，需要發(fā)展體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移方法。導入外源基因?qū)◇w的不利影響也是一個不容忽視的問題。第二十一章藥物相關(guān)的分子生物學研究 一、創(chuàng)新藥物在臨床治療中此前尚未應(yīng)用的藥物（包括新品種、新劑型、新用途、新作用機制等）。二、基于靶點和機制的藥物設(shè)計現(xiàn)代研究和開發(fā)創(chuàng)新藥物的基礎(chǔ)是尋找有效可行的干預靶點研發(fā)策略：在闡明疾病發(fā)生機制和獲得干預靶點的基礎(chǔ)上，再行合理的藥物設(shè)計（根據(jù)藥理學作用機制和構(gòu)效關(guān)系等篩選并確定先導化合物）。三、分子生物學研究促進新藥的研究分子生物學技術(shù)促進藥物靶點的發(fā)現(xiàn)和驗證。藥物作用

15、靶點：具有重要生理或病理功能，能夠與藥物相結(jié)合并產(chǎn)生藥理作 用的生物大分子及其特定的結(jié)構(gòu)位點。一種疾病可有多個藥物作用的靶點某一靶點也可以是多種疾病共同的治療靶點（一）微陣列技術(shù)在大規(guī)模篩選和發(fā)現(xiàn)靶點中的應(yīng)用1、核酸微陣列2、蛋白質(zhì)微陣列3、組織和細胞微陣列組織芯片技術(shù)：在原位針對不同樣本中的同一實驗指標進行檢測。（二）蛋白質(zhì)組學研究可提供藥物干預新靶點1、疾病相關(guān)蛋白質(zhì)組學研究2、耐藥病原體的蛋白質(zhì)組學研究3、信號轉(zhuǎn)導分子和途徑的蛋白質(zhì)組學研究（三）生物信息學在挖掘和預測藥物干預新靶點中的作用生物信息學：以大量的生物信息，尤其是人類基因組的大量原始數(shù)據(jù)為對象， 應(yīng)用計算機技術(shù)、結(jié)合其它學科知識，對原始信息進行整理、計算和開發(fā)利用。（四）RNNF涉技術(shù)用于發(fā)現(xiàn)和驗證新靶點1、反義寡核甘酸2、RNAF擾四、組合化學和高通量篩選發(fā)現(xiàn)先導化合物1、先導化合物或模型化合物的發(fā)掘2、先導化合物優(yōu)化3、候選藥物的藥理學和安全性評價4、高通量篩選技術(shù)應(yīng)用是藥物大規(guī)模篩選的趨勢第三節(jié)基因藥物將具有治療意義的DNA重組入真核表達載體，直接轉(zhuǎn)移到人體細胞，在體內(nèi)表達 出具有治療作用的多肽和蛋白質(zhì)；或應(yīng)用直接作用于細胞內(nèi)的DNM RNA抑制基 因復制和表達的核酸片段或基人工合成的類似物，以及對