細(xì)胞周期調(diào)控和檢測(cè)

1、關(guān)于細(xì)胞周期的調(diào)控與檢測(cè)第一張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 生命是如何生長(zhǎng)、生存、繁衍和死亡？在每一個(gè)生命個(gè)體中都存在一個(gè)精密的程序，或生物鐘。生物鐘決定著細(xì)胞是否、何時(shí)生長(zhǎng)、分裂、或死亡。這就是細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制，它在相關(guān)基因的控制下，依據(jù)一定的規(guī)則和節(jié)奏運(yùn)行著，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂和死亡。在胚胎細(xì)胞，細(xì)胞周期保持快速運(yùn)行，在一些成年細(xì)胞中其運(yùn)行慢得多，而在神經(jīng)元細(xì)胞周期幾乎完全不運(yùn)行。在生長(zhǎng)過(guò)程中的細(xì)胞，如果細(xì)胞周期不能運(yùn)行，結(jié)果是死亡。而在成熟細(xì)胞，細(xì)胞周期不正確的運(yùn)行，結(jié)果則是腫瘤的發(fā)生。細(xì)胞周期(cell cycle) 細(xì)胞周期調(diào)控(cell cycle regulatio

2、n) “細(xì)胞周期”也稱“細(xì)胞分裂周期”，是指一個(gè)細(xì)胞經(jīng)生長(zhǎng)、分裂而增殖成兩個(gè)所經(jīng)歷的全過(guò)程，通常可分為若干階段，即G1期、S期、G2期和M期。細(xì)胞在G1期完成必要的生長(zhǎng)和物質(zhì)準(zhǔn)備，在S期完成其遺傳物質(zhì)染色體DNA的復(fù)制，在G2期進(jìn)行必要的檢查及修復(fù)以保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性，然后在M期完成遺傳物質(zhì)到子細(xì)胞中的均等分配，并使細(xì)胞一分為二。 一、基本概念介紹第二張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2001 Nobel PrizeLeland H. Hartwell 1970s“Checkpoint”Yeast genetics100 CDC genesStart geneTim Hunt 19

3、80sCyclinsSea UrchinsPaul M. Nurse1970sCDKsyeast 二、歷史回顧第三張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月生命復(fù)制之謎的揭開(kāi) （1）1858年建立細(xì)胞理論： 生命的基本形式是細(xì)胞，機(jī)體由細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞的生長(zhǎng)復(fù)制形成了生物體的生長(zhǎng)繁衍，細(xì)胞的異常或死亡導(dǎo)致機(jī)體的疾病或死亡。 （2）1951年發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞分裂周期：G1 S G2 M G0 細(xì)胞生長(zhǎng)中有兩種形式- 有絲分裂期和細(xì)胞間期細(xì)胞周期細(xì)胞間期有絲分裂期（M期）DNA合成前期（G1期）DNA合成期（S期）DNA合成后期（G2期）前期中期后期末期第四張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（3）

4、隨著成熟刺激因子（maturation promoting factor, MPF），細(xì)胞周期素（cyclin），細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶(cyclin dependent kinase，CDK)的發(fā)現(xiàn)使對(duì)細(xì)胞周期及與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究有了很大進(jìn)展。第五張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、細(xì)胞周期各時(shí)相的動(dòng)態(tài)變化、G1期（DNA合成前期，指有絲分裂完成到DNA合成之前的一段時(shí)間） RNA在此期大量合成，導(dǎo)致蛋白質(zhì)量明顯增加。S期所需的DNA復(fù)制相關(guān)的酶系，如DNA聚合酶，G1期向S期轉(zhuǎn)變相關(guān)的蛋白質(zhì)如觸發(fā)蛋白、鈣調(diào)蛋白、細(xì)胞周期蛋白等均在此期合成。蛋白質(zhì)的磷酸化作用在G1期開(kāi)始

5、增加，這將有利于G1晚期染色體結(jié)構(gòu)成分的重排。非組蛋白、一些蛋白激酶在G1期也可發(fā)生磷酸化，已知大多數(shù)蛋白激酶磷酸化發(fā)生于其絲氨酸或蘇氨酸、酪氨酸部位。 第六張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月觸發(fā)蛋白是一種不穩(wěn)定蛋白，它對(duì)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期是必須的。只有當(dāng)其含量積累到臨界值，細(xì)胞周期才能朝DNA合成方向進(jìn)行。鈣調(diào)蛋白是真核細(xì)胞內(nèi)重要的鈣受體，它調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣的水平，鈣調(diào)蛋白的含量，在G1晚期可達(dá)峰值，用抗鈣調(diào)蛋白藥物處理細(xì)胞，可延緩其從G1期到S期的進(jìn)程。G1期蛋白質(zhì)量的增加，可能與蛋白質(zhì)合成增強(qiáng)有關(guān)，而另一原因則可能使其降解的減弱。第七張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月、S期

6、（DNA合成期，從DNA合成開(kāi)始到DNA合成結(jié)束的全過(guò)程，是細(xì)胞增殖周期的關(guān)鍵階段） S期是細(xì)胞進(jìn)行大量DNA復(fù)制的階段，組蛋白及非組蛋白也在此期大量合成，最后完成染色體的復(fù)制（）DNA復(fù)制需要多種酶的參與 包括DNA聚合酶、DNA連接酶、胸腺嘧啶核苷酸激酶、核苷酸還原酶等。隨著細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，這些酶的含量或活性可顯著增高（）DNA復(fù)制具有嚴(yán)格的時(shí)間順序 通常，GC含量較高的DNA序列在早S期復(fù)制，晚S期復(fù)制的主要為含量高的DNA序列；就染色體而言，常染色體的復(fù)制較異染色體要早，典型的例子如人類女性的細(xì)胞中，當(dāng)其它染色體都被復(fù)制完以后，才開(kāi)始進(jìn)行純化的X染色體復(fù)制。第八張，PPT共四十五

7、頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（）S期是細(xì)胞合成的主要時(shí)相 此時(shí)細(xì)胞質(zhì)中可出現(xiàn)大量的組蛋白mRNA，新合成的組蛋白從胞質(zhì)進(jìn)入胞核，與復(fù)制后的DNA迅速結(jié)合，繞成核小體，進(jìn)而形成具有兩條單體的染色體。除了蛋白質(zhì)合成以外，在S期細(xì)胞中不斷進(jìn)行著組蛋白的持續(xù)磷酸化。（）中心粒的復(fù)制也在S期完成 原本垂直的一對(duì)中心粒發(fā)生分離，各自在其垂直方向形成一個(gè)子中心粒，由此形成的兩對(duì)中心粒在以后的細(xì)胞周期進(jìn)程中，將發(fā)揮微管組織中心的作用，紡錘體微管，星體微管的形成均與此相關(guān)。第九張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月、G2期（DNA合成后期，從DNA復(fù)制完成到有絲分裂開(kāi)始前的時(shí)期，為有絲分裂 進(jìn)行物質(zhì)條件） 為細(xì)

8、胞分裂準(zhǔn)備期，細(xì)胞中合成一些與M期結(jié)構(gòu)功能相關(guān)的蛋白質(zhì)，與核膜破裂，染色體凝集相關(guān)的成熟促進(jìn)因子在此期合成。微管蛋白G期合成達(dá)高峰，為M期紡錘體微管的形成提供了豐富的來(lái)源。已經(jīng)復(fù)制的中心粒在G2期逐漸長(zhǎng)大，并開(kāi)始向細(xì)胞兩極分離。、M期（有絲分裂期，細(xì)胞經(jīng)過(guò)分裂將染色體平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞中） 在此期細(xì)胞中，染色體凝集后發(fā)生姊妹染色單體的分離，核膜核仁破裂后再重建，胞質(zhì)中有紡錘體收縮環(huán)出現(xiàn)，隨著兩個(gè)子核的形成，胞質(zhì)也一分為二，由此完成細(xì)胞分裂。第十張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月G1期：為DNA合成準(zhǔn)備所需要的RNA、 蛋白質(zhì)、脂類、糖類等G1早期：細(xì)胞的生長(zhǎng)G1晚期：為S期的DNA合

9、成做準(zhǔn)備S期（DNA合成期） DNA合成(復(fù)制) 染色體蛋白的合成：組蛋白、非組蛋白等中心粒的復(fù)制G2期（DNA合成后期）有活躍的RNA和蛋白質(zhì)合成微管蛋白，促有絲分裂因子（MPF）中心粒向兩極移動(dòng)M期（有絲分裂期） DNA、RNA、蛋白質(zhì)合成停止。 細(xì)胞發(fā)生一系列形態(tài)變化、結(jié)構(gòu)建成。將加倍的DNA平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞中第十一張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月細(xì)胞周期調(diào)控研究過(guò)程的重要事件-MPF的發(fā)現(xiàn)：最早發(fā)現(xiàn)，MPF是一種在G2期形成、能促進(jìn)M期啟動(dòng)的調(diào)控因子，稱之為促細(xì)胞成熟因子或促細(xì)胞分裂因子（MPF)。MPF由調(diào)節(jié)亞單位細(xì)胞周期素（ cyclin ）和催化亞單位細(xì)胞周期素依賴

10、性蛋白激酶（CDK）組成。1、 細(xì)胞周期調(diào)控蛋白（cell cycle- regulating protein)四、細(xì)胞周期的調(diào)控第十二張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2）細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的種類A、CDK類蛋白激酶：CDK與細(xì)胞周期素結(jié)合才具有激酶的活性，故名細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)。 作用：CDK可將特定蛋白磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞周期運(yùn)行。在動(dòng)物中已知7種CDK，CDK1-7。B、細(xì)胞周期素（cyclin)特點(diǎn)：在細(xì)胞周期中呈周期性變化。作用：能與CDK結(jié)合，激活CDK，間接調(diào)節(jié)細(xì)胞周期運(yùn)行。已知30余種，在脊椎動(dòng)物中為cycli

11、nA1-2、B1-3 、C、 D1-3、E1-2、F、G、H等。第十三張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Cyclins與CDKs結(jié)合后，CDKs才具有活性，它們兩者的結(jié)合使細(xì)胞周期有序進(jìn)行。具體結(jié)合方式如下：第十四張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月C、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI) CKI對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用，分為：Ink4: P16ink4a, P15ink4b, P18ink4c, P19ink4d。特異性抑制cdk4-cyclin D1, cdk6-cyclin D1。Kip：P21cip1、P27kip1、P57kip2，抑制大多數(shù)CDK的激酶活性。P21c

12、ip1還能與DNA聚合酶的輔助因子PCNA結(jié)合，直接抑制DNA的合成。作用機(jī)制：未完全清楚，大多數(shù)CKI是通過(guò)直接與Thr160/161磷酸化后的CDK-cyclin復(fù)合物密切結(jié)合，直接抑制其蛋白激酶活性?，F(xiàn)較為肯定的是p21，其調(diào)控水平在基因轉(zhuǎn)錄的層面，當(dāng)DNA損傷和細(xì)胞衰老時(shí)，具有轉(zhuǎn)錄因子作用的p53增高，抑制其蛋白激酶活性，阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)行。第十五張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月CDK activating活性位點(diǎn)抑制位點(diǎn)第十六張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第十七張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月由于某些環(huán)境因素的作用細(xì)胞周期出現(xiàn)故障或差錯(cuò)， 這些信號(hào)可是

13、細(xì)胞停留在某些點(diǎn)上，稱為限制點(diǎn)。主要檢驗(yàn)點(diǎn)：G1/S限制點(diǎn)：DNA是否損傷？細(xì)胞外環(huán)境是否適宜？細(xì)胞體積是否足夠大？在酵母中稱start點(diǎn)，在哺乳動(dòng)物中稱R點(diǎn)(restriction point)。S期限制點(diǎn)：DNA復(fù)制是否完成？G2/M限制點(diǎn)：DNA是否損傷？細(xì)胞體積是否足夠大？中-后期限制點(diǎn)：紡錘體組裝限制點(diǎn)。2、細(xì)胞周期限制點(diǎn)（check point）第十八張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Four checkpoints第十九張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3、調(diào)控細(xì)胞周期的內(nèi)、外源信號(hào)系統(tǒng)單細(xì)胞生物的增殖取決于營(yíng)養(yǎng)，多細(xì)胞生物細(xì)胞的增殖與信號(hào)途徑有關(guān)。A、生長(zhǎng)因子：

14、是與細(xì)胞增殖有關(guān)的信號(hào)物質(zhì)，已知幾十種，多數(shù)能促進(jìn)細(xì)胞增殖，又稱有絲分裂原（mitogen），如EGF、NGF。作用方式：旁分泌。信號(hào)通路：ras途徑，cAMP途徑、磷脂酰肌醇途徑。B、抑素（chalone)是一種由細(xì)胞自身產(chǎn)生、分泌的，對(duì)細(xì)胞增殖起抑制作用的糖蛋白，與膜上的受體結(jié)合，引起信號(hào)轉(zhuǎn)換及在胞內(nèi)傳遞，影響細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白的表達(dá)。具有嚴(yán)格的組織特異性和細(xì)胞周期階段特異性。作用于G1期的抑素可阻止細(xì)胞進(jìn)入S期，稱S因子。作用于G2期的抑素可阻止細(xì)胞進(jìn)入M期，稱M因子。第二十張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月五、 細(xì)胞周期得以進(jìn)行的兩大機(jī)制 細(xì)胞周期得以進(jìn)行的核心機(jī)制是在一系列c

15、yclin時(shí)相起伏的調(diào)控下，相應(yīng)的CDK依次激活，驅(qū)使細(xì)胞通過(guò)G1,S,G2期，達(dá)到M期，細(xì)胞一分為二，實(shí)現(xiàn)忠于親代的細(xì)胞復(fù)制。 這一過(guò)程的順利完成取決于是否啟動(dòng)（啟動(dòng)機(jī)制）和能否忠于運(yùn)行（監(jiān)控機(jī)制），達(dá)到忠實(shí)復(fù)制，是細(xì)胞周期調(diào)控的兩大生物學(xué)機(jī)制。第二十一張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1、細(xì)胞周期的啟動(dòng)機(jī)制 細(xì)胞周期能否啟動(dòng)進(jìn)行細(xì)胞增殖，主要的調(diào)控點(diǎn)在G1期，它決定細(xì)胞是否通過(guò)G1期進(jìn)入S期。這一調(diào)控點(diǎn)首先在芽殖酵母的研究中被認(rèn)識(shí)，人們稱其為“起始點(diǎn)”（START）。一旦細(xì)胞通過(guò)start,它們勢(shì)必進(jìn)入S期，完成整個(gè)細(xì)胞分裂周期。因此start有人稱之為酵母細(xì)胞周期的“決定點(diǎn)”。在

16、人體細(xì)胞增殖中，在G1期存在相似的調(diào)控機(jī)制。在G1期較晚時(shí)，也有一個(gè)決定點(diǎn)，稱為“限制點(diǎn)”（restriction point），與酵母的START功能類似，不同的是，人類細(xì)胞是否通過(guò)“限制點(diǎn)”，進(jìn)入細(xì)胞周期，主要受與細(xì)胞增殖有關(guān)的細(xì)胞外生長(zhǎng)因子的調(diào)控，而不是營(yíng)養(yǎng)素。只要有相應(yīng)的生長(zhǎng)因子存在，細(xì)胞就能通過(guò)R點(diǎn)進(jìn)入S期，完成整個(gè)細(xì)胞周期?；氐紾0/1期。相反，如果細(xì)胞在G1期就缺乏相應(yīng)的生長(zhǎng)因子，細(xì)胞周期的運(yùn)行將停止在R點(diǎn)，此時(shí)細(xì)胞進(jìn)入“安靜狀態(tài)，稱之為G0期。第二十二張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月連接信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞周期有兩條途徑，一是cyclinD/CDK4，二是cyclinE/C

17、DK2。二者都是G1期進(jìn)行的限速步驟，即cyclinD或cyclinE的過(guò)度表達(dá)，均能縮短G1期時(shí)間或加速G1期進(jìn)行第二十三張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、細(xì)胞周期的監(jiān)控機(jī)制 DNA損傷檢測(cè)點(diǎn) 抑癌基因p53在人類細(xì)胞周期G1期檢測(cè)點(diǎn)起著關(guān)鍵性作用。還存在G2期檢測(cè)點(diǎn)。時(shí)相次序監(jiān)測(cè)點(diǎn)MPF(有絲分裂促進(jìn)因子)，可以誘導(dǎo)所有細(xì)胞周期時(shí)相的細(xì)胞核發(fā)生染色體凝集。SPF(S期促進(jìn)因子)，只能誘發(fā)G1期細(xì)胞進(jìn)入S期而不能使G2期細(xì)胞進(jìn)入M期。第二十四張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月六、細(xì)胞周期的界面機(jī)制1、細(xì)胞周期與DNA修復(fù) 所有的真核細(xì)胞中都高度保守者這一整套完整的精密機(jī)制

18、，承擔(dān)著DNA損傷、錯(cuò)誤地發(fā)現(xiàn)，并將其信號(hào)傳遞給相應(yīng)的機(jī)制，去阻滯細(xì)胞周期的運(yùn)行，并同時(shí)進(jìn)行DNA損傷的修復(fù)。然后視修復(fù)情況，細(xì)胞基因的突變。決定繼續(xù)分裂或死亡，執(zhí)行一系列細(xì)胞的重要生命活動(dòng)。DNA修復(fù)方式 切除修復(fù) 錯(cuò)配修復(fù) : 將局部一段錯(cuò)配的寡核苷酸鏈切除，重新合成之堿基切除修復(fù)核苷酸切除修復(fù)全基因組切除修復(fù)轉(zhuǎn)錄切除修復(fù)第二十五張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡存在有細(xì)胞周期特異性，不同因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)生在細(xì)胞周期不同的時(shí)相 3、細(xì)胞周期與細(xì)胞分化 細(xì)胞周期不僅與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡有關(guān)，還調(diào)控著細(xì)胞分化第二十六張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于202

19、2年6月第二十七張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1、細(xì)胞周期與腫瘤的關(guān)系目前從多方面對(duì)腫瘤進(jìn)行了深入研究（流行病學(xué)、病因?qū)W、遺傳），腫瘤是多因素，多步驟，多階段的。但是腫瘤的惡性增生從生物學(xué)角度看，主要表現(xiàn)在兩方面：一是腫瘤細(xì)胞的不滅性，即細(xì)胞凋亡障礙；二是細(xì)胞增殖失控，程序發(fā)生紊亂，只是增殖超常加快。這兩方面均已成為腫瘤發(fā)生發(fā)展研究的熱點(diǎn)。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)了1.存在于正常細(xì)胞內(nèi)的原癌基因發(fā)生錯(cuò)誤轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗?.一些基因失活后正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞抑癌基因。經(jīng)過(guò)70年代的癌基因時(shí)代，80年代的抑癌基因時(shí)代90年代的多基因時(shí)代或癌基因蛋白網(wǎng)絡(luò)時(shí)代，提出了一系列的理論：腫瘤多步驟里論、DNA修

20、復(fù)理論、細(xì)胞凋亡理論，進(jìn)一步闡明細(xì)胞周期核心機(jī)制、細(xì)胞周期啟動(dòng)機(jī)制、細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)機(jī)制。七、腫瘤與細(xì)胞周期第二十八張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞周期檢控機(jī)制的破壞細(xì)胞周期中檢測(cè)DNA損傷的檢測(cè)點(diǎn)至少有兩處：一處在G1-S過(guò)渡期：控制進(jìn)入S期的檢測(cè)點(diǎn)，防止DNA受損細(xì)胞進(jìn)入S期的DNA復(fù)制。另一處在G2-M過(guò)渡期：控制進(jìn)入M期的檢測(cè)點(diǎn)，防止受損的DNA和未完成復(fù)制的DNA進(jìn)入有絲分裂。這些DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)的主要機(jī)制有二：一是p53依賴性機(jī)制，另一是p53非依賴性機(jī)制每一個(gè)完整的檢測(cè)點(diǎn)應(yīng)由四部分組成，即發(fā)現(xiàn)或傳感器（detect或sensor）、制動(dòng)或拘留（stop

21、or arrest）、修復(fù)（repair）、決定（decision，divide or death）。理論上說(shuō)監(jiān)測(cè)點(diǎn)的任何一部分出了問(wèn)題，都會(huì)導(dǎo)致功能的異常，結(jié)果是遺傳不穩(wěn)定，基因受損的細(xì)胞存活和復(fù)制或細(xì)胞遺傳物質(zhì)的改變，如此細(xì)胞多步驟進(jìn)化，最終成為失控性生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞。第二十九張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3、腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞周期驅(qū)動(dòng)機(jī)制的破壞細(xì)胞周期監(jiān)測(cè)點(diǎn)功能的減弱，導(dǎo)致突變基因的累積和正常細(xì)胞的進(jìn)化，只有當(dāng)這些累積的突變基因破壞了細(xì)胞周期驅(qū)動(dòng)機(jī)制，細(xì)胞才能進(jìn)入失控性生長(zhǎng)的境界。人們把細(xì)胞周期驅(qū)動(dòng)機(jī)制比作一輛汽車或引擎，驅(qū)使其運(yùn)行的因素好比“油門”；制動(dòng)器運(yùn)行的機(jī)制猶如“剎車”。

22、持續(xù)地踏住“油門” 或“剎車”失靈，終將失控。這正是致變因素導(dǎo)致基因突變，檢測(cè)點(diǎn)基因突變，突變基因累積，驅(qū)動(dòng)機(jī)制失控的必然結(jié)果。 腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，監(jiān)控機(jī)制破壞的典型例子是P53基因的突變。大約50%的人類腫瘤都存在P53基因的突變，說(shuō)明DNA損傷檢測(cè)點(diǎn)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中，具有重要的位置。第三十張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月From: British J. Cancer 87:129-133第三十一張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1:222-231Mutation of G1/S regulators in human cancer第三十二張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作

23、于2022年6月八、常用的細(xì)胞周期檢測(cè)方法流式細(xì)胞術(shù)PI(碘化丙錠),可以與細(xì)胞內(nèi)DNA和RNA結(jié)合,采用RNA抑制劑將RNA消化后,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到的與DNA結(jié)合的PI的熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)DNA含量的多少。由于細(xì)胞周期各時(shí)相的DNA含量不同,因此,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)PI染色法對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測(cè)時(shí),可以將細(xì)胞周期各時(shí)相區(qū)分為G1/G0期,S期和G2/M期,并可通過(guò)特殊軟件計(jì)算各時(shí)相的百分率:G1/G0期具有二倍體細(xì)胞的DNA含量(2N),G2/M期具有四倍體細(xì)胞的DNA含量(4N),S期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。值得注意的是,PI不能通過(guò)細(xì)胞膜完整的細(xì)胞(如活細(xì)胞和早期

24、凋亡細(xì)胞),在標(biāo)本制備時(shí),必須先用乙醇或其他破膜劑增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性,才能使PI進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞內(nèi)的核酸結(jié)合。乙醇通常為終濃度為70%的冷乙醇。第三十三張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月將腫瘤細(xì)胞以1106接種于60mm培養(yǎng)板，80匯合后傳代。2472小時(shí)后用胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗兩遍，棄上清，加入70預(yù)冷乙醇中，吹打均勻，4固定12小時(shí)以上。PBS洗滌去乙醇，1000rpm, 5min，洗兩遍。0.5 ml PBS重懸細(xì)胞，加入PI和 RNaseA至終濃度50g/ml，37 溫浴30 min。用流式細(xì)胞儀測(cè)定周期。PI：碘化丙啶，以PBS配成1mg/ml，4保存。RNaseA：1

25、0mg/ml D、方法：第三十四張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月G2MG0G1s0 200 400 600 8001000G0G1sG2MDNA AnalysisDNA contentCount2N4NNormal Cell Cycle Purdue University Cytometry Laboratories第三十五張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月G1S phaseG2MG112 1DNA content The Cell CycleDNA content by flow cytometryDeconvolution into cell cycle phasesG0

26、/1G2/MSEvents第三十六張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月Measurement of sub G0/1 apoptotic particlesDNA contentEventsEventsG0/1G2/MSApoptosis第三十七張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4 hr, control28 hr, irradiatedG1: 94.1%S: 1.5%G2/M: 4.4%G1: 94.1%S: 1.1%G2/M: 4.8%G1: 60.6%S: 34.9%G2/M: 4.5%G1: 96.6%S: 1.6%G2/M: 1.8%10%1%90%4%28 hr, c

27、ontrol28 hr, aphidicolin 第三十八張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月O hr6 hr12 hr18 hr24 hr93.5%86.5%58.5%21.0%2%Induction of p21 results in parallel loss of NPAT foci, down-regulation of histone gene expression and inhibition of S phase entry (1)2 hr4 hr6 hr8 hr10 hr12 hr14 hr24 hr0 hrG1: 47.2%S: 34.2%G2/M: 18.7%G1: 46.3%S: 34.9%G2/M: 18.8%G1: 51.9%S: 29.8%G2/M: 18.4%G1: 56.1%S: 23.9%G2/M: 20.1%G1: 57.8%S: 17.8%G2/M: 24.5%G1: 58.5%S: 12.5%G2/M: 29.0%G1: 60.2%S: 6.8%G2/M: 33.0%G1: 60.0%S: 3.9%G2/M: 36.1%G1: 62.1%S: 2.4%G2/M: 35.5%B.A.第三十九張，PPT共四十五頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、BrdU摻入法 (S phase) A、原理： 在含有