維生素D臨床知識(shí)和產(chǎn)品培訓(xùn)

1、關(guān)于維生素D臨床知識(shí)與產(chǎn)品培訓(xùn)第一張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、維生素D檢測(cè)臨床意義1、維生素D簡(jiǎn)介2、維生素D生理功能3、維生素D與疾病第二張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1）理化性質(zhì)（2）代謝過(guò)程31、維生素D簡(jiǎn)介第三張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 維生素D是一種脂溶性維生素，維生素D與動(dòng)物骨骼的鈣化有關(guān),故又稱(chēng)為鈣化醇。也被看作是一種作用于鈣、磷代謝的激素前體，它與陽(yáng)光有密切關(guān)系，所以又叫“陽(yáng)光維生素”。維生素D是一族A、B、C、D環(huán)結(jié)構(gòu)相同，但側(cè)鏈不同的一類(lèi)復(fù)合物的總稱(chēng)，目前已知的維生素D至少有10種，但最重要的是維生素D2（麥角骨化

2、醇）和維生素D3（膽鈣化醇）。 維生素D易被紫外光破壞，因此，含維生素D的試劑均應(yīng)避光保存。（1）理化性質(zhì)第四張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月維生素D2是紫外線(xiàn)照射植物中的麥角固醇產(chǎn)生，在自然界存在較少。維生素D3則由大多數(shù)高級(jí)動(dòng)物的表皮和真皮內(nèi)含有的7-脫氫膽固醇經(jīng)紫外線(xiàn)照射轉(zhuǎn)變而成。維生素D2維生素D3（1）理化性質(zhì)第五張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 含量較多的食物有魚(yú)肝油、含油脂的魚(yú)類(lèi)如（三文魚(yú)、沙丁魚(yú) ,魚(yú)肝油）、奶油、雞蛋黃、雞鴨肝等動(dòng)物肝臟以及牛奶。另外，維生素D可由人體經(jīng)紫外線(xiàn)照射后生成，所以日光浴是取得維生素D的可靠來(lái)源，所以提倡多做戶(hù)外活動(dòng)。Vi

3、t D主要來(lái)源（2）代謝過(guò)程第六張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（2）代謝過(guò)程第七張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月機(jī)體主要的調(diào)節(jié)因子：1,25(OH)2D3本身甲狀旁腺激素血清鈣和磷的濃度維生素D的分解代謝主要在肝臟，代謝物進(jìn)入膽汁入腸，隨糞便排出。在體內(nèi)，維生素D主要儲(chǔ)存在脂肪組織與骨骼肌中，肝臟、大腦、肺、脾、骨骼和皮膚中也存在少量。（2）代謝過(guò)程第八張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月維生素D肝臟25-羥化酶25（OH）D腎臟1-羥化酶1，25（OH）2 D 血P（）（）血Ca（）（）（+）血PPTH（+）血Ca()CT（+）(+)（2）代謝過(guò)程第九

4、張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1）調(diào)節(jié)鈣磷代謝（2）調(diào)節(jié)細(xì)胞分化（3）調(diào)節(jié)免疫力102、生理功能第十張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月調(diào)節(jié)鈣磷代謝：維生素D與甲狀旁腺素共同作用，維持血鈣水平穩(wěn)定。這對(duì)正常骨骼的礦化、肌肉收縮、神經(jīng)傳導(dǎo)以及體內(nèi)所有細(xì)胞的功能都是必需的。生理循環(huán)圈起點(diǎn)為甲狀旁腺內(nèi)鈣受體對(duì)鈣的識(shí)別。當(dāng)血鈣水平下降時(shí)，甲狀旁腺分泌PTH，刺激腎25-OH-D-12-氧化酶從25-OH-D3儲(chǔ)存池中轉(zhuǎn)化更多的1,25-(OH)2D3。隨PTH水平的升高， 1,25-(OH)2D3增加，導(dǎo)致腸、骨和腎中鈣轉(zhuǎn)運(yùn)增多，促進(jìn)鈣在腎小管的重吸收，將鈣從骨骼中動(dòng)員出來(lái)

5、，在小腸促進(jìn)結(jié)合蛋白質(zhì)的合成，增加鈣吸收，最終使血鈣恢復(fù)正常水平。（1）調(diào)節(jié)鈣磷代謝第十一張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月調(diào)節(jié)鈣磷代謝：這個(gè)過(guò)程均由甲狀旁腺的鈣受體進(jìn)行識(shí)別。PTH分泌減少不僅是由鈣活性反饋，也可由與1,25-(OH)2D3有關(guān)短反饋環(huán)路直接抑制甲狀旁腺分泌PTH。當(dāng)血鈣過(guò)高時(shí)，促進(jìn)甲狀旁腺產(chǎn)生降鈣素，阻止鈣從骨髓中的動(dòng)員，增加鈣磷經(jīng)尿中排出。維生素D缺乏將導(dǎo)致25-(OH)D3和1,25-(OH)2D3的合成減少，鈣內(nèi)環(huán)境出現(xiàn)失衡,并且要不斷地提高PTH的水平，表現(xiàn)為繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)。（1）調(diào)節(jié)鈣磷代謝第十二張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月與

6、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的關(guān)系：近年來(lái)的研究資料表明，正常皮膚成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞都有VD受體， VD缺乏大鼠的皮膚顆粒細(xì)胞層變薄，角蛋白改變和細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶活性降低等。VD3可抑制培養(yǎng)的小鼠角化細(xì)胞和正常人表皮細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其分化。也有資料表明VD3有抑制白血病細(xì)胞株M1增殖并誘導(dǎo)使之分化為成熟的單核細(xì)胞，延長(zhǎng)動(dòng)物存活時(shí)間的作用。VD3對(duì)其他腫瘤細(xì)胞也有明顯的抗增殖和誘導(dǎo)分化的作用。（2）調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化第十三張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月對(duì)免疫系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)：?jiǎn)魏?巨噬細(xì)胞是非特異性免疫反應(yīng)的主要防御機(jī)制。體外實(shí)驗(yàn)證明VD3可促使白血病細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞向巨噬細(xì)

7、胞轉(zhuǎn)化，并增強(qiáng)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的吞噬活性及殺菌能力。VD缺乏的人和動(dòng)物對(duì)非特異性炎癥刺激的反應(yīng)能力有明顯的降低，而且有吞噬活性和趨化功能障礙。（3）調(diào)節(jié)免疫第十四張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 維生素D的各種功效都是由其受體調(diào)節(jié)的。維生素D受體除了在腸和骨中表達(dá)外，還在腦、前列腺、乳房、結(jié)腸、免疫細(xì)胞、血管平滑肌和心肌細(xì)胞中表達(dá)。參考文獻(xiàn)1)Holick MF . Vitamin D deficiency. N Engl J Med 2007;357;266-812)Wang T J et al .Vitamin D deficiency and risk of cardio

8、vascular disease.circulation 2008 ;117;503-511第十五張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 體內(nèi)維生素D水平不足與非骨骼性疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加有相關(guān)性，包括：心血管疾病、高血壓、癌癥、糖尿病、多發(fā)性硬化癥、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、傳染性疾病等。參考文獻(xiàn)1)Holick MF . Vitamin D deficiency. N Engl J Med 2007;357;266-812)Wang T J et al .Vitamin D deficiency and risk of cardiovascular disease.circulation 2008

9、 ;117;503-511第十六張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3、維生素D與疾?。?）佝僂病、手足搐搦癥（2）骨軟化?。?）骨質(zhì)疏松（4）維生素D中毒第十七張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月病 因 1、日光照射不足主要病因2、VitD攝入不足 3、生長(zhǎng)速度快4、藥物等5藥物影響（1）佝僂病、手足抽搐癥第十八張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月19第十九張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月VitD CaP 骨樣組織鈣化障礙且繼續(xù)增殖骨骺端鈣化障礙骺線(xiàn)參差不齊鈣化帶增厚或毛刷樣、 杯口樣改變骨樣組織堆積骨骺端膨出肋骨串珠手鐲、腳鐲骨干鈣化障礙骨質(zhì)疏松

10、彎曲變形（郝氏溝、“O”、 “X”腿）病理性骨折扁平骨鈣化障礙顱骨軟化骨樣組織堆積方顱病理（1）佝僂病、手足抽搐癥第二十張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月胸部：多見(jiàn)于1歲左右小兒.肋骨串珠雞胸郝氏溝漏斗胸上述畸形均使胸腔變小，影響呼吸功能.臨床表現(xiàn)（1）佝僂病、手足抽搐癥第二十一張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 四 肢腕踝6個(gè)月以上小兒手鐲、腳鐲下肢 1歲以上小兒“O”“X ”型腿（1）佝僂病、手足抽搐癥（1）佝僂病、手足抽搐癥第二十二張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月全身肌張力下降，骨骼?。海ㄗ?、站、走晚）腹肌肌張力下降，呈蛙腹（1）佝僂病、手足抽搐癥第

11、二十三張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月神經(jīng)興奮性改變：腦皮層功能減低的表現(xiàn)條件反射形成慢表情淡漠語(yǔ)言發(fā)育落后 免疫力低下：易合并感染、且易遷延、反復(fù)（1）佝僂病、手足抽搐癥第二十四張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月血生化改變明顯血Ca稍下降血P明顯下降25（OH）D3 1，25（OH)2D3X線(xiàn)改變：長(zhǎng)骨 骨骺軟骨明顯增寬 2mm 干骺端鈣化帶消失，呈毛刷樣、杯口樣改變 骨質(zhì)普遍稀疏，密度減低 骨干可有彎曲或骨折CaP明顯下降 AKP明顯升高輔助檢查（1）佝僂病、手足抽搐癥第二十五張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月輔助檢查（1）佝僂病、手足抽搐癥第二十六張

12、，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月治療 （一）維生素D制劑： 口服法維生素D 20004000 IU/d （50100 ug/d) 1,25(OH)2D3(羅鈣全) 0.52.0 ug/d （2080 IU/d ）一個(gè)月后改為預(yù)防量(400 IU/d ) 肌注法：適合重癥、不能口服者VitD3：2030萬(wàn)IU初期：1次激期：23次，間隔24周23月后給預(yù)防量。注意同時(shí)用鈣劑（1）佝僂病、手足抽搐癥第二十七張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（二）鈣劑治療 肌注VitD時(shí) 有搐搦者 食物中鈣量不足者 適應(yīng)癥（三）矯形治療治療 （1）佝僂病、手足抽搐癥第二十八張，PPT共一百一

13、十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3、嬰兒期：口服400800 IU/d （不可間斷） 4、幼兒期：夏季增加戶(hù)外活動(dòng)，可不用VitD冬季（10月中旬） 南方：1020萬(wàn)IU（肌注 ）北方：2040萬(wàn)IU （肌注 ）（1）佝僂病、手足抽搐癥第二十九張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月30（2）骨軟化病 骨軟化病由于成人缺乏維生素D及鈣質(zhì)引起骨基質(zhì)礦化障礙，以骨質(zhì)軟化和骨骼畸形為特征。病人多為女性。 第三十張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月臨床表現(xiàn) 骨痛活動(dòng)常受限，步態(tài)搖擺、步行困難，病理性骨折，長(zhǎng)骨、肋骨、骨盆和脊柱骨均可發(fā)生胸廓兩側(cè)內(nèi)陷，胸腔縮小兩側(cè)肋緣可及髂嵴或其間距明顯縮短

14、。骨盆三葉畸形，身高縮短，可達(dá)cm以上。 （2）骨軟化病第三十一張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月骨質(zhì)軟化癥X線(xiàn)表現(xiàn) 早期普遍性骨質(zhì)疏松，密度減低，骨皮質(zhì)變薄，嚴(yán)重者呈線(xiàn)條狀。髓腔透亮度增加。骨小梁先是模糊，最終消失，可出現(xiàn)多個(gè)囊狀透光區(qū)。（2）骨軟化病第三十二張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 2.假骨折是骨質(zhì)軟化癥的X線(xiàn)特點(diǎn)（稱(chēng)為L(zhǎng)ooser帶）。表現(xiàn)為橫越骨皮質(zhì)的透明線(xiàn)，其邊緣密度略高，常呈對(duì)稱(chēng)而多發(fā)。多見(jiàn)于肩胛骨、肋骨、坐骨、恥骨等。骨折處無(wú)骨痂形成和錯(cuò)位，日久可出現(xiàn)骨骼彎曲畸形。（2）骨軟化病骨質(zhì)軟化癥X線(xiàn)表現(xiàn)第三十三張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年

15、6月骨質(zhì)軟化癥X線(xiàn)表現(xiàn)假骨折，Looser帶（2）骨軟化病第三十四張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月雙凹征 骨質(zhì)軟化癥X線(xiàn)表現(xiàn)（2）骨軟化病第三十五張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月治療維生素D缺乏補(bǔ)充維生素D 維生素D3400800IU 一般不超過(guò)每日4000IU 增加鈣磷攝入（2）骨軟化病第三十六張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月VDDRI 1,25雙羥維生素D3（羅鈣全）1.0g/日維生素D220,000-100,000U/日或25羥維生素D（0.1-1.0mg/日）增加鈣磷攝入： 鈣劑1-1.5克/日 （2）骨軟化病第三十七張，PPT共一百一十四頁(yè)，

16、創(chuàng)作于2022年6月正常骨 骨質(zhì)疏松骨 以骨強(qiáng)度受損 導(dǎo)致骨折危險(xiǎn)性升高為特征的骨骼疾病。骨強(qiáng)度主要反映了骨密度和骨質(zhì)量?jī)蓚€(gè)方面的綜合特征。NIH Consensus Development Panel on Osteoporosis. JAMA 285 (2001): 785-95（3）骨質(zhì)疏松第三十八張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月39（3）骨質(zhì)疏松第三十九張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（3）骨質(zhì)疏松第四十張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月臨床表現(xiàn)骨痛（腰背酸疼痛）骨折身高縮短，骨骼畸形功能障礙（活動(dòng)受限）（3）骨質(zhì)疏松第四十一張，PPT共一百一十

17、四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月骨質(zhì)疏松常見(jiàn)骨折椎體骨折橈骨遠(yuǎn)端骨折髖部骨折肱骨外科頸骨折38%19%19%（3）骨質(zhì)疏松第四十二張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月防治藥物骨吸收抑制劑 骨形成促進(jìn)劑鈣劑 氟化物維生素D 甲狀旁腺素二膦酸鹽 維生素D降鈣素 合成類(lèi)固醇雌激素選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑（3）骨質(zhì)疏松第四十三張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月發(fā)病機(jī)理：血漿中25（OH）D3水平過(guò)高，而不是1,25（OH）2D3水平升高造成。高維生素D血癥病人血中25（OH）D濃度可比正常個(gè)體高15倍，但是他們的1,25（OH）2D3水平?jīng)]有顯著變化。短期多次大劑量維生素D治療維生素D預(yù)

18、防劑量過(guò)大誤診佝僂病錯(cuò)誤治療44（4）維生素D中毒第四十四張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月診斷：維生素D過(guò)量病史早期血鈣升高：高于3mmol/LX線(xiàn)檢查：軟組織鈣化45（4）維生素D中毒第四十五張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、維生素D檢測(cè)指南與方法1、維生素D檢測(cè)指南2、維生素D檢測(cè)方法第四十六張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1、維生素D檢測(cè)指南（1）維生素D缺乏診斷程序（2）建議維生素D缺乏危險(xiǎn)人群飲食補(bǔ)充維生素D（3）維生素D治療和預(yù)防策略第四十七張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 內(nèi)分泌學(xué)會(huì)2011年6月6日發(fā)表維生素D缺乏評(píng)估、

19、治療和預(yù)防的臨床實(shí)踐指南 全文見(jiàn)Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism與內(nèi)分泌學(xué) 該指南針對(duì)不同年齡段、不同疾病背景的維生素D缺乏高危、低危人群，進(jìn)一步明確了維生素D缺乏的有效評(píng)估、飲食補(bǔ)充和藥物預(yù)防治療的具體實(shí)施方法，指明了維生素D在非血鈣受益上的不確定性，旨在達(dá)到維生素D缺乏防治的最優(yōu)化第四十八張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 內(nèi)分泌學(xué)會(huì)2011年6月6日發(fā)表維生素D缺乏評(píng)估、治療和預(yù)防的臨床實(shí)踐指南 指南認(rèn)為。維生素D缺乏的高危人群（例如西班牙裔、黑種人、妊娠婦女和肥胖個(gè)體等）應(yīng)當(dāng)接受維生素D水平篩查。外周血血清25

20、-羥基維生素D水平低于20ng/ml者應(yīng)被診斷為維生素D 缺乏。全文見(jiàn)Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism與內(nèi)分泌學(xué)第四十九張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 內(nèi)分泌學(xué)會(huì)2011年6月6日發(fā)表維生素D缺乏評(píng)估、治療和預(yù)防的臨床實(shí)踐指南 全文見(jiàn)Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism與內(nèi)分泌學(xué) 指南中寫(xiě)道，現(xiàn)有的所有證據(jù)均表明，兒童和成人預(yù)防佝僂病或骨軟化的最低血25-羥維生素D水平應(yīng)為20 ng/ml，但為了增強(qiáng)維生素D對(duì)鈣、骨骼以及肌肉代謝的積極影響，血25-羥維生

21、素D的水平應(yīng)高于30 ng/ml。第五十張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月指南推薦的維生素D缺乏的診斷程序： 推薦對(duì)于有維生素D缺乏危險(xiǎn)者，采用可靠方法檢測(cè)其血清循環(huán)25-羥維生素D25（OH）D水平，以評(píng)價(jià)患者體內(nèi)的維生素D狀況。維生素D缺乏定義為25（OH）D水平低于20 ng/ml（50nmol/L）。不推薦使用血清1，25二羥維生素D 1，25（OH）2D檢測(cè)評(píng)價(jià)維生素D缺乏，僅在監(jiān)測(cè)特定情況如獲得性和遺傳性維生素D和磷酸鹽代謝紊亂時(shí)應(yīng)用51（1）維生素D缺乏診斷程序第五十一張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 25（OH）D是血液循環(huán)中維生素D最主要的存在形式，

22、半衰期23周，是監(jiān)測(cè)維生素D狀態(tài)的最佳指標(biāo)。 1,25（OH）2D在血液中濃度比25（OH）D低1000倍，半衰期約4小時(shí)，且對(duì)PTH、鈣、磷的調(diào)控非常敏感，1,25（OH）2D不能反映維生素D的儲(chǔ)備水平，血清1,25（OH）2D在維生素D缺乏時(shí)經(jīng)常是正常的甚至升高，因此檢測(cè)其濃度對(duì)于監(jiān)測(cè)病人的維生素D的狀態(tài)沒(méi)有幫助。（1）維生素D缺乏診斷程序第五十二張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月維生素D缺乏評(píng)估、治療和預(yù)防的臨床實(shí)踐指南建議維生素D缺乏危險(xiǎn)人群飲食補(bǔ)充維生素D（2）建議補(bǔ)充維生素D第五十三張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月維生素D缺乏評(píng)估、治療和預(yù)防的臨床實(shí)踐指南

23、建議維生素D缺乏危險(xiǎn)人群飲食補(bǔ)充維生素D（2）建議補(bǔ)充維生素D第五十四張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月維生素D缺乏評(píng)估、治療和預(yù)防的臨床實(shí)踐指南建議維生素D缺乏危險(xiǎn)人群飲食補(bǔ)充維生素D（2）建議補(bǔ)充維生素D第五十五張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月建議維生素D缺乏危險(xiǎn)人群飲食補(bǔ)充維生素D（2）建議補(bǔ)充維生素D每IU=25ng第五十六張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月建議維生素D缺乏危險(xiǎn)人群飲食補(bǔ)充維生素D（2）建議補(bǔ)充維生素D維生素D可耐受維持量的上限： -即除醫(yī)生建議外均不可超過(guò)的限量第五十七張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月維生素D缺乏評(píng)估

24、、治療和預(yù)防的臨床實(shí)踐指南治療和預(yù)防策略（3）治療和預(yù)防策略第五十八張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月維生素D缺乏評(píng)估、治療和預(yù)防的臨床實(shí)踐指南治療和預(yù)防策略（3）治療和預(yù)防策略第五十九張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月維生素D缺乏評(píng)估、治療和預(yù)防的臨床實(shí)踐指南治療和預(yù)防策略（3）治療和預(yù)防策略第六十張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（3）治療和預(yù)防策略第六十一張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2、維生素D檢測(cè)方法（1）體內(nèi)維D水平含量與意義（2）檢測(cè)維生素D的方法第六十二張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月63體內(nèi)血中25-羥維生素D

25、水平含量與意義缺乏100ng/ml250nmol/L據(jù)估計(jì)，全世界大約10億人未達(dá)到維生素D足量濃度的最低限30ng/ml（1）體內(nèi)維D水平含量與意義第六十三張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月臨床常見(jiàn)方法幾種方法學(xué)對(duì)比ELISA的兩種產(chǎn)品對(duì)比64檢測(cè)維生素D的方法（2）檢測(cè)維生素D的方法第六十四張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1）酶聯(lián)免疫法（ELISA）：IDS、BH（2）化學(xué)放光免疫法（CLIA）：雅培、索靈、貝克曼等（3）電化學(xué)發(fā)光法（ECLI）：羅氏651、臨床常見(jiàn)方法（2）檢測(cè)維生素D的方法第六十五張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月酶聯(lián)免疫法使抗

26、原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。 使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。662、幾種方法學(xué)對(duì)比

27、（2）檢測(cè)維生素D的方法第六十六張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析：又稱(chēng)化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA ) , 是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體的免疫分析方法。常用于標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)有吖啶酯類(lèi)化合物acridinium ester (AE) , 其通過(guò)起動(dòng)發(fā)光試劑作用而發(fā)光, 強(qiáng)烈的直接發(fā)光在一秒鐘內(nèi)完成, 為快速的閃爍發(fā)光。靈敏度和精確度比酶免法、熒光法高幾個(gè)數(shù)量級(jí)，可以完全替代放射免疫分析、徹底淘汰酶聯(lián)免疫分析。主要具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、試劑價(jià)格低廉、試劑穩(wěn)定且有效期（6-18個(gè)月）、方法穩(wěn)定快速、檢測(cè)范圍寬、操作簡(jiǎn)單自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。672、幾種方法學(xué)對(duì)

28、比（2）檢測(cè)維生素D的方法第六十七張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月電化學(xué)發(fā)光技術(shù)：在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，用電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)32+標(biāo)記Ab，通過(guò)Ag-Ab反應(yīng)和磁珠分離技術(shù)，根據(jù)三聯(lián)吡啶釕在電極上發(fā)出的光強(qiáng)度對(duì)待測(cè)的Ag或Ab進(jìn)行定量/定性。高度敏感，可達(dá)pgml或pmol水平；特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，CV5。測(cè)定范圍寬，可達(dá)7個(gè)數(shù)量級(jí)。試劑穩(wěn)定，無(wú)毒害，無(wú)污染，有效期長(zhǎng)，達(dá)數(shù)月至數(shù)年。操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，易于自動(dòng)化。在對(duì)環(huán)保很重視的國(guó)家，CLIA成了取代RIA的首選方法。682、幾種方法學(xué)對(duì)比（2）檢測(cè)維生素D的方法第六十八張，PPT共一百一十

29、四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月方法靈敏度(檢出限)批內(nèi)變異系數(shù)批間變異系數(shù)線(xiàn)性范圍放免法0.1ng/ml3.84.1%6.49.5%5個(gè)數(shù)量級(jí)酶聯(lián)免疫法ng/ml10-13mol/L4.56.4%5.646.5%2個(gè)數(shù)量級(jí)免疫熒光法10-15mol/L5%5%4個(gè)數(shù)量級(jí)膠體金層析法ng/ml10%10%化學(xué)發(fā)光法pg/ml3.1%3.54.6%36個(gè)數(shù)量級(jí)電化學(xué)發(fā)光pg/ml10-1210-18mol/ml5%5%7個(gè)數(shù)量級(jí)時(shí)間分辨熒光免疫法pg/ml10-19mol/ml3.84.3%4.95.8%45個(gè)數(shù)量級(jí)69免疫標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)對(duì)比（2）檢測(cè)維生素D的方法第六十九張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作

30、于2022年6月IDSvsBH：.exl重復(fù)性：批內(nèi)、批間時(shí)間：703、ELISA的兩種產(chǎn)品對(duì)比對(duì)比項(xiàng)目BHIDS線(xiàn)性范圍5100ug/L9.3151.2nmol/L批內(nèi)CV10%5.36.7%批間CV15%4.68.7%回收率20%101%靈敏度5ug/L5nmol/L標(biāo)本量5ul25ul測(cè)量時(shí)間超過(guò)75min超過(guò)3h（2）檢測(cè)維生素D的方法第七十張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、博暉維生素D試劑盒介紹博暉公司維生素D3檢測(cè)原理維生素D3檢測(cè)試驗(yàn)準(zhǔn)備與流程維生素D3檢測(cè)試驗(yàn)步驟與數(shù)據(jù)分析維生素D3檢測(cè)操作規(guī)范及注意事項(xiàng)第七十一張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1

31、） ELISA簡(jiǎn)介（2）維生素D3檢測(cè)中競(jìng)爭(zhēng)法應(yīng)用原理721、博暉公司維生素D3檢測(cè)原理第七十二張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 定義與原理 ELISA又叫酶聯(lián)反應(yīng)，是一種免疫測(cè)定 。基礎(chǔ):抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。 ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。（1）酶聯(lián)反應(yīng)簡(jiǎn)介第七十三張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：1、

32、固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）2、酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）3、酶作用的底物（顯示計(jì)） 可設(shè)計(jì)出各種不同類(lèi)型的檢測(cè)方法 ELISA檢測(cè)法必要試劑（1）酶聯(lián)反應(yīng)簡(jiǎn)介第七十四張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月常用ELISA類(lèi)型夾心法競(jìng)爭(zhēng)法雙抗體夾心法雙抗原夾心法BH100檢測(cè)原理為：雙抗體夾心法25-OH-維生素D3檢測(cè)：競(jìng)爭(zhēng)法（1）酶聯(lián)反應(yīng)簡(jiǎn)介第七十五張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 競(jìng)爭(zhēng)法：是利用待測(cè)抗原和酶標(biāo)抗原與特異性抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，或待測(cè)抗體和酶標(biāo)抗體與特異性抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合而進(jìn)行測(cè)定的一種方法 競(jìng)爭(zhēng)法示意圖（2）維生素D3檢測(cè)中競(jìng)爭(zhēng)法應(yīng)用原理第七十六張，PPT共一

33、百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 25-OH-VD3試劑盒（酶聯(lián)免疫法-競(jìng)爭(zhēng)法），定量測(cè)定人體血清中的25羥基維生素D3，校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、樣品均被樣品稀釋液稀釋?zhuān)♂尯蟮臉悠泛屠备鶚?biāo)記的25羥基維生素D3抗原在包被了鼠單克隆抗體的微孔中溫育1小時(shí)后洗版，然后利用TMB顯色。終止反應(yīng)后利用酶標(biāo)儀讀取吸光度值。顏色的強(qiáng)度和25-OH-VD3的濃度成反比 。北京博暉公司研發(fā)的25-OH-VD3試劑盒原理概述（2）維生素D3檢測(cè)中競(jìng)爭(zhēng)法應(yīng)用原理第七十七張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月782、維生素D3檢測(cè)試驗(yàn)準(zhǔn)備與流程（1）BH公司VD3檢測(cè)試劑盒（2）自備材料與設(shè)備（3）試劑準(zhǔn)備（4）

34、維生素D3檢測(cè)實(shí)驗(yàn)流程第七十八張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月25-羥基維生素D3檢測(cè)試劑盒包含內(nèi)容注：試劑盒在2-8攝氏度，有效期一年（1）BH公司VD3檢測(cè)試劑盒第七十九張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月0.5ml及以上的玻璃或聚丙烯微量離心管； 注意：聚苯乙烯試管不適合，不要重復(fù)使用試管。高精度加樣器（10ul、和200ul）以及對(duì)應(yīng)槍頭旋渦震蕩器；自動(dòng)洗板機(jī)（可選擇）；酶標(biāo)儀和數(shù)據(jù)分析裝置； 適用于具有450nm、630nm波長(zhǎng)的所有全自動(dòng)和半自動(dòng)酶標(biāo)儀恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水浴箱。（2）自備材料與設(shè)備第八十張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月定標(biāo)血清和質(zhì)

35、控血清：定標(biāo)血清和質(zhì)控血清以?xún)龈善返男问教峁?，使用前?fù)溶于500ul蒸餾水中。蓋緊瓶蓋，室溫下放置10-15min，期間顛倒搖晃幾次，使其充分溶解，保存于2-8一周。工作洗滌液：將濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋20倍后備用。其他試劑直接使用-所有試劑使用之前應(yīng)該平衡至室溫并反復(fù)顛倒混勻。（3）試劑準(zhǔn)備第八十一張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1-6-試劑與樣本配制與準(zhǔn)備；7-13-實(shí)驗(yàn)操作步驟14-15-數(shù)據(jù)檢測(cè)（4）維生素D3檢測(cè)實(shí)驗(yàn)流程第八十二張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月樣品N孔，質(zhì)控2孔，定標(biāo)血清5孔6：酶標(biāo)板排版5：標(biāo)準(zhǔn)品五系列配制10uL樣品血清+400稀釋液（

36、41倍稀釋?zhuān)?：樣品配制10uL復(fù)溶質(zhì)控血清+400稀釋液（41倍稀釋?zhuān)?：質(zhì)控品配制25uL復(fù)溶定標(biāo)血清+1000uL稀釋液。（41倍稀釋?zhuān)?：標(biāo)準(zhǔn)品母液配制復(fù)溶：定標(biāo)血清、質(zhì)控高、中值血清干粉+500ul蒸餾水1：復(fù)溶干粉（4）維生素D3檢測(cè)實(shí)驗(yàn)流程第八十三張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（4）維生素D3檢測(cè)實(shí)驗(yàn)流程第八十四張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月853、維生素D3檢測(cè)試驗(yàn)步驟與數(shù)據(jù)分析（1）維生素D3檢測(cè)實(shí)驗(yàn)步驟（2）維生素D3檢測(cè)數(shù)據(jù)分析第八十五張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月試劑的復(fù)溶或準(zhǔn)備見(jiàn)“試劑準(zhǔn)備”。1） 準(zhǔn)備玻璃管或聚丙烯管并

37、做好標(biāo)記，每個(gè)定標(biāo)血清、質(zhì)控血清和樣本對(duì)應(yīng)一個(gè)管。a定標(biāo)血清的稀釋?zhuān)簩?duì)應(yīng)的試管中加入1000ul樣本稀釋液，然后加入25ul復(fù)溶的定標(biāo)血清（濃度100ug/L），即用樣本稀釋液41倍稀釋?zhuān)糜谛郎u混合器上混合10秒。 其余4個(gè)定標(biāo)點(diǎn)80ug/L、40ug/L、20ug/L、0ug/L用40倍稀釋好的100ug/L的定標(biāo)血清按表1進(jìn)行稀釋?zhuān)海?）檢測(cè)試驗(yàn)操作步驟第八十六張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月質(zhì)控血清和樣本的稀釋?zhuān)河脴颖鞠♂屢悍謩e將質(zhì)控血清和樣本41倍稀釋?zhuān)缑總€(gè)試管中加入400ul的樣本稀釋液，然后分別加入對(duì)應(yīng)編號(hào)的10ul質(zhì)控血清和樣本，置于旋渦混合器上混合10秒。

38、如稀釋的總量不同，可參照表2進(jìn)行稀釋?zhuān)海?）檢測(cè)試驗(yàn)操作步驟第八十七張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2） 于相應(yīng)的酶標(biāo)板微孔中加入50ul已稀釋好的定標(biāo)血清、質(zhì)控血清或樣本，再加入50ul的酶工作液。貼上封口膠，于37條件下孵育1小時(shí)。（粉色）（1）檢測(cè)試驗(yàn)操作步驟第八十八張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月圖示：加酶后顯色（1）檢測(cè)試驗(yàn)操作步驟第八十九張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3） 用工作洗滌液洗板5次，a手動(dòng)洗版：迅速將板顛倒倒出孔內(nèi)物，每孔加入300ul工作洗滌液，b自動(dòng)洗版：設(shè)置洗板機(jī)分配每孔至少300ul工作洗滌液。注：在進(jìn)入下一步前，于吸

39、水紙上用力拍打倒置的板以除去多余的工作洗滌液（1）檢測(cè)試驗(yàn)操作步驟第九十張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月洗板機(jī) 清洗包被板 示意圖（1）檢測(cè)試驗(yàn)操作步驟第九十一張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4）每孔加入50ul的底物液A和50ul的底物液B，貼上封口膠，于37下孵育，恒溫水浴箱中反應(yīng)時(shí)間為10分鐘，恒溫培養(yǎng)箱或恒溫鼓風(fēng)干燥箱中反應(yīng)時(shí)間為15分鐘。圖示：加底物液后顏色變?yōu)樗{(lán)色（1）檢測(cè)試驗(yàn)操作步驟第九十二張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月圖示：酶標(biāo)儀檢測(cè)讀數(shù)5）每孔加入50ul終止液。在加入終止液后立即于450nm、 630nm波長(zhǎng)處讀取吸光度。（1）檢

40、測(cè)試驗(yàn)操作步驟第九十三張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月維生素D3檢測(cè)試驗(yàn)數(shù)據(jù)案例濃度=LN(OD值/3.3317)/-0.0165（2）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析第九十四張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月數(shù)據(jù)記錄和計(jì)算方法數(shù)據(jù)處理軟件人工處理數(shù)據(jù) 人工數(shù)據(jù)處理步驟和方法1、excel抄錄酶標(biāo)儀數(shù)據(jù)2、選中全部數(shù)據(jù)，插入散點(diǎn)圖 （2）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析第九十五張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月鼠標(biāo)點(diǎn)擊曲線(xiàn)右鍵-選擇添加趨勢(shì)線(xiàn)（2）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析第九十六張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第九十七張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月X=LN(Y/5.4619)/

41、-0.4244（2）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析第九十八張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月【參考值（參考范圍）】 本公司采用的參考值范圍：19-57.6ug/l（47.5-144nmol/L）每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立自己的參考范圍，本試劑盒檢測(cè)結(jié)果僅作為輔助診斷手段之一，供臨床醫(yī)生參考。（2）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析第九十九張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月【檢驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算與解釋】 根據(jù)5個(gè)定標(biāo)液數(shù)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，25-OH-D3濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行指數(shù)曲線(xiàn)擬合。 R不小于0.990，質(zhì)控?cái)?shù)值波動(dòng)在正負(fù)20%。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和每個(gè)樣本檢測(cè)的OD值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上找到對(duì)應(yīng)的25-OH-D3濃度

42、值（ug/l或nmmol/L）。1、57.6ug/l（144nmmol/L），說(shuō)明25-羥基維生素D3充足。（2）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析第一百?gòu)?，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月【檢驗(yàn)方法的局限性】1、本試劑盒測(cè)定范圍為5-100ug/l（12.5-250nmmol/L）。超出試劑盒測(cè)定范圍的測(cè)定結(jié)果是通過(guò)校準(zhǔn)品曲線(xiàn)外延得出的計(jì)算結(jié)果，不作為準(zhǔn)確定量數(shù)據(jù)。使用前應(yīng)先對(duì)樣本進(jìn)行稀釋。診斷結(jié)果應(yīng)結(jié)合患者的臨床癥狀和醫(yī)師其他的實(shí)驗(yàn)室檢查進(jìn)行分析。2、加完終止液后應(yīng)立即在酶標(biāo)儀450nm、630nm處讀數(shù)（2）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析第一百零一張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1）維生素D3檢測(cè)操作

43、規(guī)范（2）維生素D3檢測(cè)注意事項(xiàng)4、維生素D3檢測(cè)操作規(guī)范及注意事項(xiàng)第一百零二張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 實(shí)驗(yàn)前復(fù)溫：將試劑及所需數(shù)量的微孔反應(yīng)條和凍在冰箱內(nèi)的血清標(biāo)本置室溫平衡（20-25）十分鐘以上。儀器準(zhǔn)備：洗板機(jī)、酶標(biāo)儀、恒溫設(shè)備開(kāi)啟（37度）洗滌液準(zhǔn)備：蒸餾水配制洗滌液1：19稀釋標(biāo)本：血清或血漿（當(dāng)天最好）（1）維生素D3檢測(cè)操作規(guī)范第一百零三張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)中復(fù)溫：將試劑及所需數(shù)量的微孔反應(yīng)條置室溫平衡，試劑樣品使用前必須達(dá)到室溫（20-25）后才能使用，未用完的板條應(yīng)立即用封片封好，避光冷藏保存；復(fù)溶：質(zhì)控品、定標(biāo)品凍干粉用

44、500ul蒸餾水復(fù)溶五濃度標(biāo)準(zhǔn)品配制：五個(gè)系列定標(biāo)品濃度的配制(見(jiàn)說(shuō)明書(shū))41倍稀釋?zhuān)?1倍血清樣本的稀釋和質(zhì)控品的稀釋微孔板上排序有序，設(shè)好標(biāo)準(zhǔn)位，樣品位，質(zhì)控位加樣：加稀釋后的樣品，質(zhì)控品，定標(biāo)品50uL（1）維生素D3檢測(cè)操作規(guī)范第一百零四張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)中加酶液：加入酶液50微升，加入酶液時(shí)避免吸頭接觸孔壁及孔內(nèi)樣本，即垂直而不碰避。如有接觸，請(qǐng)更換吸頭；最后并加貼封片孵育： 恒溫培養(yǎng)箱或恒溫水浴箱均為1小時(shí)洗板：在第一步孵育結(jié)束后，小心將封片揭下并棄掉，用洗板機(jī)洗滌5次，拍干?；蚴窒矗ㄊ窒辞跋鹊沟艨字幸后w，洗5次，每次放置30秒，每次倒掉液體后需拍干包被板）（1）維生素D3檢測(cè)操作規(guī)范第一百零五張，PPT共一百一十四頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月實(shí)驗(yàn)中加顯色液：每孔中加入50微升顯色液A，再每孔加入50微升顯色液B。恒溫培養(yǎng)箱孵育15分鐘或恒溫水浴箱中10分鐘，第二次孵育結(jié)束后，小心將封口膠揭開(kāi)。加入終止液：加液過(guò)程中避免碰到小孔邊緣或其中的試劑，盡量避免污染。