16 別構(gòu)酶及其動(dòng)力學(xué)

1、第十一章 別構(gòu)酶及其動(dòng)力學(xué) 1別構(gòu)效應(yīng)（allosteric effect）： 寡聚酶（蛋白）上一個(gè)活性部位的改變通過(guò)構(gòu)象變化影響到其它活性部位的效應(yīng)別構(gòu)酶（allosteric enzyme)： 能產(chǎn)生別構(gòu)效應(yīng)的酶。除了有一個(gè)活性中心外，還有別構(gòu)效應(yīng)劑結(jié)合位別構(gòu)效應(yīng)劑（allosteric effector) ： 作用于酶活性中心外的某處，通過(guò)促使酶分子空間構(gòu)象的改變而影響酶的催化。 酶的別構(gòu)效應(yīng)可由底物結(jié)合引起， 也可由別構(gòu)效應(yīng)劑結(jié)合引起的。2一 別構(gòu)酶及其作用特性(一) 概述 ：別構(gòu)效應(yīng)是機(jī)體代謝的重要方式代謝調(diào)節(jié)的方式： 遲緩調(diào)節(jié): 需時(shí)間長(zhǎng)，幾個(gè)小時(shí)。通過(guò)改變酶 分子的合成、降解、酶

2、原轉(zhuǎn)化來(lái)控 制細(xì)胞內(nèi)酶分子濃度。 快速調(diào)節(jié): 時(shí)間短幾秒或幾分鐘。對(duì)體內(nèi)現(xiàn)有 的酶進(jìn)行激活或抑制。 調(diào)節(jié)酶: 在體內(nèi)代謝過(guò)程中起快速調(diào)節(jié)作用的酶 包括共價(jià)調(diào)節(jié)酶和別構(gòu)酶3(二) 別構(gòu)酶作用特性-協(xié)同效應(yīng)(cooperative effect) 協(xié)同效應(yīng)：一個(gè)配體與蛋白或酶結(jié)合后對(duì)另一配體結(jié)合的影響 1. 分類： 同種效應(yīng)：一個(gè)分子的配體與蛋白或酶結(jié)合對(duì)后續(xù)同種 或同類配體結(jié)合的影響。 異種效應(yīng)：一個(gè)分子的配體與蛋白或酶結(jié)合對(duì)不同種或 不同類配體結(jié)合的影響。 正協(xié)同效應(yīng)： 一分子的配體與蛋白或酶結(jié)合可促進(jìn)下一分 子配體與蛋白和酶結(jié)合的效應(yīng)。 負(fù)協(xié)同效應(yīng)： 一分子的配體與蛋白或酶結(jié)合使其它配體的

3、結(jié)合力降低的效應(yīng)。4例如: 四亞基蛋白（酶） P + L K1 PL1 K2 PL2 K3 PL3 K4 PL4 內(nèi)在解離常數(shù): K1 = K2 = K3 =K4 無(wú)協(xié)同 K1 K2 K3 K4 正協(xié)同 K1 K2 K3 K4 負(fù)協(xié)同右圖中 : a 為無(wú)協(xié)同(雙曲線) b 正協(xié)同效應(yīng)(S形曲線) c 負(fù)協(xié)同效應(yīng) (表觀雙曲線)VSabc52. 協(xié)同效應(yīng)實(shí)例: (1) 正協(xié)同實(shí)例 ATCase （66） Asp + 氨甲酰磷酸 氨甲酰-L -Asp + Pi (過(guò)量 ) ATP產(chǎn)生異種正協(xié)同效應(yīng)：別構(gòu)激活 CTP產(chǎn)生異種負(fù)協(xié)同效應(yīng)：別構(gòu)抑制 VAspVmVm/2KmappATPCTP6尿素和有機(jī)

4、汞處理可選擇性破壞酶的效應(yīng)劑結(jié)合位脫敏作用：酶失去了原有的對(duì)效應(yīng)劑的敏感性脫敏后的酶仍然保持催化底物的能力，但不再呈現(xiàn)S形動(dòng)力學(xué)，說(shuō)明：催化亞基底物結(jié)合位調(diào)節(jié)亞基ATP、CTP結(jié)合位 酶有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn) ATP和CTP兩種效應(yīng)劑 可能是結(jié)合在同一部位。 ATC酶效應(yīng)劑結(jié)合位的 存在對(duì)S型動(dòng)力學(xué)是必要的7 ATCase的別構(gòu)效應(yīng)表現(xiàn)為四級(jí) 結(jié)構(gòu)的大幅度變動(dòng)： 利用ATCase的二底物過(guò)渡態(tài)類似物：PALA（N-膦乙酰-L-Asp)的研究表明： ATCase的6個(gè)亞基的底物結(jié)合位都位于催化鏈之間的 界面上，活性中心相距2.2nm 結(jié)合PALA后的酶，催化三聚體彼此拉開1.2nm，同時(shí) 旋轉(zhuǎn)10；并使

5、分別位于催化鏈N-端與C-端的氨甲酰 磷酸結(jié)合位和Asp 結(jié)合位彼此靠近，成為高親和狀態(tài) 一個(gè)催化亞基的構(gòu)象變化通過(guò)亞基界面之間的相互作 用，傳遞給另一個(gè)催化三聚體，并引起后者構(gòu)象的轉(zhuǎn)變8(2) 負(fù)協(xié)同效應(yīng)： 3-P-甘油醛脫氫酶：3-P-甘油醛 + NAD+ + Pi NADH + 1,3-2P-甘油酸 +H + 半位反應(yīng)性：該酶為四聚體，但4個(gè)活性部位中只 有2個(gè)起作用兔肌 3 P-甘油醛脫氫酶與NAD+結(jié)合的解離常數(shù)解離常數(shù) 透析平衡法 熒光測(cè)定法 K1 10-10M 110-8 M K2 1 則 Rs81 正協(xié)同 若n81 負(fù)協(xié)同n V ESn Vm = E0 = Ys14Hill模式

6、的缺陷 : 假設(shè)n分子底物和酶的結(jié)合一步完成，過(guò)于理想化 Hill模式用于研究別構(gòu)模式時(shí)，對(duì)四個(gè)亞基酶來(lái) 說(shuō)n=4，但實(shí)際n= 2.62.8之間。并且在負(fù)協(xié)同 時(shí)，要求 n1Log ( V ) Vm-V LogS15(二) MWC模式： Monod-Wyman-Changeux :于1965年提出，也稱齊變模式1. 模式要點(diǎn): 別構(gòu)蛋白是一種寡聚體，由多個(gè)相同原體構(gòu)成。原體是寡聚蛋白最小的功能單位，它們?cè)趧e構(gòu)蛋白中占有相等的地理位置。寡聚蛋白至少有一個(gè)對(duì)稱軸。 每個(gè)亞基對(duì)同一種配體只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。 蛋白亞基可具有R型和T型兩種構(gòu)象。這兩種構(gòu)象在無(wú)底物和效應(yīng)劑存在時(shí)處于平衡狀態(tài)。 蛋白亞基都只

7、能取相同的構(gòu)象，無(wú)雜合體。亞基齊步轉(zhuǎn)變 亞基的構(gòu)象可變，但蛋白分子的對(duì)稱性不變。 無(wú)論多少配體結(jié)合到酶上，配體與R態(tài) 和T態(tài)酶的內(nèi)在解離常數(shù)都相等， 分別以KR和KT表示。162.MWC解釋底物的同種協(xié)同效應(yīng)。 以四聚體別構(gòu)蛋白為例：平衡常數(shù)L = T R R KR1 RS KR2 RS2 KR3 RS3 KR4 RS4 T KT1 TS KT2 TS2 KT3 TS3 KT4 TS4 KR1 = KR = R S RS = 4 RS 4 RS KR KR2 = 2KR = RS S RS2 = 6RS 2 3 RS2 KR2 KR3 = 3KR = RS2S RS3 = 4RS 3 2 RS

8、3 KR3 KR4 = 4KR = RS3 S RS4 = RS 4 RS4 KR4L17同理可求知： TS 、 TS2 、 TS3 、 TS4 Ys = RS+2RS2+3RS3+4RS4+TS+2TS2+3TS3+4TS4 4 ( R+RS+ RS2 + RS3 + RS4 +T+ TS+ TS2+TS3 + TS4 ) R S ( 1+ S ) 3 + T S ( 1+ S ) 3 = KR KR KT KT R ( 1+ S ) 4 + T ( 1+ S ) 4 KR KT定義： L = T ， C= KR , = S , C= S R KT KR KT Ys = V = ( 1+ )

9、 3 + L C (1+C ) 3 Vm ( 1+ ) 4 + L (1+C ) 4 18若酶結(jié)合位點(diǎn)為n， 則： Ys = ( 1+ ) n-1 + L C (1+C ) n-1 ( 1+ ) n + L (1+C ) n 討論 : 若S只與R態(tài)結(jié)合 ，則 KT C= KR/KT= 0 則 Ys = ( 1+ ) n-1 ( 1+ ) n + L 假設(shè)：n=4，以V 作圖，L 越大，S型越明顯 可解釋底物的同種正協(xié)同效應(yīng) VL=1L=10L=1000L=100L=10000C=0n=419 若酶只有一種形式: 只有T態(tài)，R =0, L = T /R Ys = VVm = C = S 1+ C

10、 KT + S 只有R態(tài)，T =0, L = T /R =0 Ys = VVm = = S 1+ KR + S 若KR=KT , 則 C=1: Ys= /（1+ ） = S KR + S 若n=1 (只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn))：Ys= S KR ( 1+L )+ S 1+LCYs= ( 1+ ) n-1+LC(1+C) n-1 ( 1+ ) n + L (1+C ) n203. MWC解釋異種協(xié)同效應(yīng): R L T ， 設(shè)KRKT ( S優(yōu)先與R結(jié)合) 激活劑A使酶處于R態(tài)；抑制劑I 使酶處于T態(tài) 以二亞基酶為例: T KI1 TI KI2 TI2 L R KA1 RA KA2 RA2 KA1 = K

11、A = AR RA = 2 AR 2 RA KA KA2 = 2KA= RA A RA2 = RA 2 RA2 KA2同理： TI = 2 TI TI2 = TI 2 KI KI2KI:KA ，KI: 激活劑、抑制劑 與酶的內(nèi)在解離常數(shù)21 I L= T + TI + TI2 = T (1+ KI )2 R+ RA + RA2 R (1+ A )2 KA L= T , = I , = A ，則： L= L ( 1+) 2 R KI KA 1+ 若結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為n： 則 L= L ( 1+) n 1+ 有底物存在時(shí): 由于KR KT , C0 Ys= (1+ ) n-1 = (1+ ) n-1 L

12、+ (1+ )n L ( 1+) n + (1+ )n 1+ 22討論: 若只有激活劑存在，I=0時(shí), 則=0 : L= L(1+) n L 表明R濃度下降，處于不利于和底物結(jié)合的T態(tài)的酶比例增加別構(gòu)抑制。 缺限: 要求酶的構(gòu)象變化是齊步的 沒(méi)有考慮到負(fù)協(xié)同效應(yīng)L=L ( 1+ ) n 1+23ssssssss(三) KNF模式Koshland-Nemethy-Filmer 于1966年提出1. 模式要點(diǎn): 對(duì)聚合體酶來(lái)說(shuō)，每個(gè)亞基可有R和T兩種狀 態(tài)，但在無(wú)底物和效應(yīng)劑存在時(shí)只有T態(tài)。 亞基的構(gòu)象改變可由于且只能由于配基和底物的結(jié)合引起，構(gòu)象的改變是序變過(guò)程，存在雜合體 酶構(gòu)象的改變只影響相

13、鄰亞基的變化，使其他配基的親和力增加或減小。ss242 KNF模式與底物協(xié)同：以二亞基酶為例，酶受到底物誘導(dǎo)可能的構(gòu)象變化：定義平衡常數(shù)：T態(tài)R態(tài)S+ SSSTTTRRR+ S+ SS+ KtKSRKTT+ KTR+ KRR25 由T2 TR包含三步：S+ ST2 TR或RTSSR2+ S 由TR R2也包含三步：Keq = R2 = Kt KSR KRR TR S KTRKeq = TR = Kt KSR KTR T2 S KTT 令：KTT=1, T2=1 S+ S消失， 或 生成SS或 消失， 生成SS+ SSSS或S 26酶活性中心底物的飽和分?jǐn)?shù)： 總TR +2 R2 Ys = 2(T

14、2 +總TR +R2)TR +RT =總 TR= 2Kt KSR KTR SR2 = Kt KSR KRR S TR = Kt 2 KSR 2 KRR S 2 KTR 幾率因子=排列方式數(shù)= Kt KSR KTR S + Kt2 KSR2 KRR S 2 1+ 2Kt KSR KTR S + Kt 2 KSR 2 KRR S 2 Ys 對(duì)S作圖是一條S形曲線1 亞基轉(zhuǎn)變2 亞基締合方式3 底物與R 結(jié)合數(shù)量4 底物濃度項(xiàng)27若KRR=KTR=1， 即亞基之間無(wú)相互作用，則： YS = Kt KSR KTR S + Kt 2 KSR 2 KRR S 2 1+ 2Kt KSR KTR S + Kt

15、2 KSR2 KRR S2 = Kt KSR S + Kt 2 KSR2 S 2 （ 1+ Kt KSR S）2 = S 1/ Kt KSR+S 符合米氏動(dòng)力學(xué)28 對(duì)于四亞基酶，其亞基排布有三種：SSSS22SS22SSSSSSSSSSSSSSSS22T3R=2( KtKSR KTR + KtKSR KTR2 ) S TR3=2 Kt3KSR3 S 3 ( KTR KRR2 + KTR2 KRR)T2R2= Kt2KSR2 S 2 ( KTR2 KRR +2 KTR KRR +2 KTR3+ KTR2)R4=Kt4KSR4 KRR3 S 4 29 四亞基酶飽和分?jǐn)?shù)表達(dá)式： T3R + 2T2

16、R2 +3 TR3+ 4R4 Ys = 4(T4 + T3R +T2R2 +TR3 +R4) S 4SS4SS2SSS4SSSSS4S6SS4SSSSSST3R=4KtKSR KTR3 S T3R=4KtKSR KTR2 S 303 KNF模式與效應(yīng)劑：激活劑與酶結(jié)合后，不影響酶繼續(xù)結(jié)合底物； 而抑制劑結(jié)合到酶分子上之后，使酶的構(gòu)象發(fā)生改變，不再與底物結(jié)合解釋異種協(xié)同效應(yīng)以二亞基酶為例。激活劑與底物共存時(shí)：A+ AAA+ ASSSSASAASA+ A+ + A+ ASSA+ ASASA+ S+ S+ S+ S+ S+ S+ S+ S222222A+AKAR31 抑制劑與底物共存：KtC態(tài)I+

17、IKICRI=2Kt Kt KSR KIC KRC S I 先求出各種酶形式的濃度，然后帶入飽和分?jǐn)?shù)表達(dá)式 + I+ ISSS+ S+ SI+ ISI+ S222II32(四) EIG模式:也稱為總模式（general scheme），是1967年由Eigen提出的。 要點(diǎn): 酶無(wú)論是否結(jié)合配體，亞基的構(gòu)象都能發(fā)生變化 在同種酶分子中不同的構(gòu)象的雜合體都能依次與 底物結(jié)合 ssssssssssssssssss33四 酶的記憶與滯后現(xiàn)象(一) 酶的記憶現(xiàn)象： Rabin模式來(lái)解釋: E +S K1 ES 慢 Ka E S K2 E + P K -1 K-a 酶本身有一個(gè)緩慢異構(gòu)化過(guò)程。V S作圖

18、呈現(xiàn)S形若ESES異構(gòu)化很快，酶應(yīng)符合米氏動(dòng)力學(xué)激活劑可以加快異構(gòu)化速度，減小S形性質(zhì) 抑制劑延緩異構(gòu)化過(guò)程，增強(qiáng)S形性質(zhì)+SKb慢34 Richard 模式：假定： 單亞基酶在無(wú)底物存在時(shí)， 也具有兩種處于平衡狀態(tài)的異構(gòu)型：方形和圓形。兩者都可與底物結(jié)合，但方形與底物的親和力高于圓形。結(jié)合底物后的酶被誘導(dǎo)出現(xiàn)第三種構(gòu)象：六角形，但后者必須恢復(fù)到方形之后方能放出產(chǎn)物和游離態(tài)的方形酶。 酶的記憶現(xiàn)象：酶在釋放出產(chǎn)物之后， 仍然能“記得”它在釋放出產(chǎn)物前的有利構(gòu)象，而不再恢 復(fù)原有構(gòu)象的現(xiàn)象。具有記憶現(xiàn)象的酶稱為記憶酶。 記憶酶并不是別構(gòu)酶：記憶酶是單體酶而非別構(gòu)酶 記憶酶分子構(gòu)象的改變不是協(xié)同作用+S k-akaSPP+S緩慢35(二) 酶的滯后現(xiàn)象：酶的滯后現(xiàn)象：酶對(duì)配體應(yīng)答延緩的現(xiàn)象 如兔肌肉中磷酸化酶，加入底物糖原后幾分鐘才有產(chǎn)物放出。 所有具有記憶現(xiàn)象的酶都有滯后現(xiàn)象，但有滯后效應(yīng)的酶不一定都是記憶酶。滯后半時(shí)間：以加入配體開始到反應(yīng)恢復(fù)正常所需時(shí)間的一半?？捎糜诤饬棵傅臏蟪潭?。P滯后t36具有滯后現(xiàn)象的酶可以是單體酶， 也可以是寡聚酶 其它具有滯后現(xiàn)象的酶： 寡聚酶由于亞基的聚合或解聚作用緩慢 MWC或KNF模式中若T、