聚丙烯酰胺凝膠電泳原理及方法

1、發(fā)來點(diǎn)子布時(shí)源：擊量：段選擇：間：11-10032大中小06-01聚丙烯酰胺凝膠電泳原理及方法聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的電泳方法。在這種支持介 質(zhì)上可根據(jù)被分離物質(zhì)分子大小和分子電荷多少來分離。聚丙烯酰胺凝膠有以下優(yōu)點(diǎn)：聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和N，N甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝膠有 格子是帶有酰胺側(cè)鏈的碳-碳聚合物，沒有或很少帶有離子的側(cè)基，因而電滲作用比較小，不 易和樣品相互作用。由于聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的物質(zhì)，在聚合前可調(diào)節(jié)單體的濃度比，形 成不同程度交鏈結(jié)構(gòu)，其空隙度可在一個(gè)較廣的范圍內(nèi)變化，可以根據(jù)要分離物質(zhì)分子的大 小，選擇合適的凝膠成分，使

2、之既有適宜的空隙度，又有比較好的機(jī)械性質(zhì)。一般說來，含丙 烯酰胺7-7.5%的凝膠，機(jī)械性能適用于分離分子量范圍不1萬至100萬物質(zhì)，1萬以下的蛋白 質(zhì)則采用含丙烯酰胺15-30%的凝膠，而分子量特別大的可采用含丙烯酰胺4%的凝膠，大孔膠 易碎，小孔膠則難從管中取出，因此當(dāng)丙烯酰胺的濃度增加時(shí)可以減少雙含丙烯酰胺，以改進(jìn) 凝膠的機(jī)械性能。在一定濃度范圍聚丙烯酰胺對熱穩(wěn)定。凝膠無色透明，易觀察，可用檢測儀直接 測定。丙烯酰胺是比較純的化合物，可以精制，減少污染。合成聚丙烯酰胺凝膠的原料 是丙烯酰胺和甲撐雙丙烯酰胺。丙烯酰胺稱單體，甲撐雙丙烯酰胺稱交聯(lián)劑，在水溶液中，單 體和交聯(lián)劑通過自由基引發(fā)的

3、聚合反應(yīng)形成凝膠。在聚丙烯酰胺凝膠形成的反應(yīng)過程中，需要有催化劑參加，催化劑包括引發(fā)劑和另速劑兩 部分。引發(fā)劑在凝膠形成中提供始自由基，通過自由基的傳遞，使丙烯酰胺成為自由基，發(fā)動 聚合反應(yīng)，加速劑則可加快引發(fā)劑放自由基的速度。常用的引發(fā)劑和加速劑的配伍如下表：聚合反應(yīng)催化劑配伍引發(fā) 加劑 速劑NH T42S2O8 EMED(NH4 D2S2O8 MAPN核黃 T素EMED注：（NH42S2O8,過硫酸胺TEMED： N, N, N, N;四甲基乙二胺DMAPN：B一二甲基胺 基丙晴用過硫酸銨引發(fā)的反應(yīng)稱化學(xué)聚合反應(yīng)；用核黃素引發(fā)，需要強(qiáng)光照射反應(yīng)液，稱光聚合反應(yīng)。聚丙烯酰胺聚合反應(yīng)可受下列因

4、素影響：1、大氣中氧能淬滅自由基，使聚合反 應(yīng)終止，所以在聚合過程中要使反應(yīng)液與空氣隔絕。2、某些材料如有機(jī)玻璃，能抑制聚合 反應(yīng)。3、某些化學(xué)藥物可以減慢反應(yīng)速度，如赤血鹽。4、溫度高聚合快，溫度低聚合慢。以上幾點(diǎn)在制備凝膠時(shí)必須加以注意。凝膠的篩孔，機(jī)械強(qiáng)度及透明度等很大程度上由凝膠的 濃度和交聯(lián)決定。每100亳升凝膠溶液中含有單體和交聯(lián)劑的總克數(shù)稱凝膠濃度，常用T%表 達(dá)；凝膠溶液中交聯(lián)劑占單體和交聯(lián)體總量的百分?jǐn)?shù)稱為交聯(lián)度，常用C%表示，可用下式計(jì)公式a：丙烯酰胺克數(shù)；b：甲撐雙丙烯酰胺克數(shù)；m：緩沖液體積 （毫升）凝膠濃度過高時(shí)，凝膠硬而脆，容易破碎；凝膠濃度太低 時(shí)，凝膠稀軟，不易

5、操作。交聯(lián)度過高，膠不透明并缺乏彈性；交聯(lián)度過低，凝膠呈糊 狀。聚丙烯酰胺凝膠具有較高的粘度，它不防止對流減低擴(kuò)散的能 力，而且因?yàn)樗哂腥瓤臻g網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，某分子通過這種網(wǎng)孔的能力 將取決于凝膠孔隙和分離物質(zhì)顆粒的大小和形狀，這是凝膠的分子篩 作用。由于這種分子篩作用，這里的凝膠并不僅是單純的支持物，因 此，在電泳過程中除了注意電泳的基本原理以外，還必須注意與凝膠 本身有關(guān)的各種性質(zhì)（網(wǎng)孔的大小和形狀等）?？赏ㄟ^下式計(jì)算來選 擇適當(dāng)?shù)哪z網(wǎng)孔。公式式中：P為網(wǎng)孔平均直徑，C為多聚體濃度，d為該多聚體分 子直徑（若不是卷曲的分子應(yīng)為5A），K為常數(shù)，K值取決于漲膠的幾 何構(gòu)型，假如多聚體的鏈?zhǔn)且?/p>

6、近似于直角交聯(lián)的，則約為1.5根據(jù)此 式，我們可以通過多聚體濃度C近似地計(jì)算出網(wǎng)孔直徑，例如已知多 聚體濃度為5%，其網(wǎng)孔平均直徑應(yīng)為：公式這樣的計(jì)算是粗略的，與實(shí)際情況有一定距離，有人測定了 總濃度（T）為20%的丙烯酰胺液，在六種不同比例的雙丙烯酰胺存在 下，聚合后的網(wǎng)孔大小，發(fā)現(xiàn)孔徑與總濃度有關(guān)，總濃度愈大，孔徑 相應(yīng)變小，機(jī)械強(qiáng)度增強(qiáng)，與總濃度不變時(shí)，甲叉雙丙烯酰胺（Bis的 濃度在5%時(shí)孔徑最小，高于或低于此值時(shí)，聚合體孔徑都相對變大， 凝膠孔徑在凝膠電泳中是一個(gè)重要的參數(shù)，它往往決定了電泳的分離 效果。經(jīng)過不斷的實(shí)踐，得到了如表3所示的經(jīng)驗(yàn)值，在一般情況 下，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)

7、采用7.5%濃度的凝膠，所得電泳結(jié)果往 往是滿意的，因此稱由此濃度組成的凝膠為“標(biāo)準(zhǔn)凝膠”。對那些用于重要研究的凝膠，最好是通過采用10%的一系列凝膠 濃度梯進(jìn)行預(yù)先試驗(yàn)，以選出最適凝膠濃度。表3不同分子量范圍的蛋白質(zhì)和核酸在凝膠電泳中所選用的 凝膠濃度百分率物 分 適質(zhì) 子量范圍用的凝膠濃度（%）蛋5X10520 10-15 5-102-5核1酸104104-0-20 5-105105-102-3.62X106聚丙烯酰胺凝膠電泳可分為連續(xù)的和不連續(xù)的兩類，前者指 整個(gè)電泳系統(tǒng)中所用緩沖液，pH值和凝膠網(wǎng)孔都是相同的，后者是指 在電泳系統(tǒng)中采用了兩種或兩種以上的緩沖液，pH值和孔徑，不連續(xù) 電

8、泳能使稀的樣品在電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨能力。蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)，它的遷移率取決于它所 帶凈電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果加入一種試劑使電荷因 素消除，那電泳遷移率就取決于分子的大小，就可以用電泳技術(shù)測定 蛋白質(zhì)的分子量。1967年，Shapiro等發(fā)現(xiàn)陰離子去污劑十二烷基硫 酸鈉（SDS）具有這種作用。當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入足夠量SDS和巰基 乙醇，SDS可使蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵還原。由于十二烷基硫酸根帶負(fù) 電，使各種蛋白質(zhì)一SDS復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷，它的量大大 超過了蛋白質(zhì)分子原的電荷量，因而掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間原有的電 荷差別，SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，還可

9、引起構(gòu)象改變，蛋白質(zhì)SDS復(fù)合 物形成近似“雪茄煙”形的長橢圓棒，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短 軸長度都不一樣，約為18A，這樣的蛋白質(zhì)一SDS復(fù)合物，在凝膠中的 遷移率，不再受蛋白質(zhì)原的電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大 小，因而SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可以用于測定蛋白質(zhì)的分子量。蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私怆娪緦?shí)驗(yàn)原理掌握電泳實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程用電泳方法測定蛋白分子量聚丙烯酰胺凝膠電泳原理及方法二、實(shí)驗(yàn)原理最廣泛使用的不連續(xù)緩沖系統(tǒng)最早是由Ornstein(1964和Davis(1964設(shè)計(jì) 的，樣品和濃縮膠中含Tris-HCl(pH 6.8,上下槽緩沖液含Tris-甘氨酸(pH

10、8.3,分離膠中含 Tris-HCl(pH 8.8。系統(tǒng)中所有組分都含有0.1%的SDS(Laemmli, 1970。樣品和濃縮膠中的 氯離子形成移動界面的先導(dǎo)邊界而甘氨酸分子則組成尾隨邊界，在移動界面的兩邊界之間是- 電導(dǎo)較低而電位滴度較陡的區(qū)域，它推動樣品中的蛋白質(zhì)前移并在分離膠前沿積聚。此處pH 值較高，有利于甘氨酸的離子化，所形成的甘氨酸離子穿過堆集的蛋白質(zhì)并緊隨氯離子之后， 沿分離膠泳動。從移動界面中解脫后，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物成一電位和pH值均勻的區(qū)帶泳動穿 過分離膠，并被篩分而依各自的大小得到分離。SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物 的流體力學(xué)和光學(xué)性

11、質(zhì)表明，它們在水溶液中的形狀，近似于雪茄煙 形狀的長橢園棒，不同蛋白質(zhì)的SDS復(fù)合物的短軸長度都一樣(約為 18A，即1.8nm)，而長軸則隨蛋白質(zhì)分子量成正比地變化。這樣的 SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，在凝膠電泳中的遷移率，不再受蛋白質(zhì)原有電荷 和形狀的影響，而只是橢園棒的長度也就是蛋白質(zhì)分子量的函數(shù)。由于SDS和巰基乙醇的作用，蛋白質(zhì)完全變性和解聚，解離 成亞基或單個(gè)肽鏈，因此測定的結(jié)果只是亞基或單條肽鏈的分子量。SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍取決于用于 灌膠的聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度。在沒有交聯(lián)劑的情況下聚合的丙 烯酰胺形成毫無價(jià)值的粘稠溶液，而經(jīng)雙丙烯酰胺交聯(lián)后凝膠的剛性 和抗張強(qiáng)度都有

12、所增加，并形成SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物必須通過的小孔。 這些小孔的孔徑隨“雙丙烯酰胺丙烯酰胺”比率的增加而變小， 比率接近1： 20時(shí)孔徑達(dá)到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝膠大多按“雙丙烯酰胺丙烯酰胺”為1： 29配制，試驗(yàn)表明它能分離大小相差只 有3%的蛋白質(zhì)。凝膠的篩分特性取決于它的孔徑，而孔徑又是灌 膠時(shí)所用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺絕對濃度的函數(shù)。用515%的丙烯酰 胺所灌制凝膠的線性分離范圍如下表：SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍*丙烯酰線性分離范 胺濃度圍(kD)(%) TOC o 1-5 h z 1512431016687.536945.057212*雙丙烯酰胺丙烯酰胺摩爾比為1： 29。聚丙

13、烯酰胺凝膠電泳原理及方法三、實(shí)驗(yàn)材料和試劑試劑丙烯酰胺和N, N -亞甲雙丙烯酰胺。以溫?zé)?利于溶解雙 丙烯酰胺)的去離子水配制含有29% (w/v)丙烯酰胺和1% (w/v)N,N -亞甲雙丙烯酰胺的貯存液，丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在貯存過程 中緩慢轉(zhuǎn)變?yōu)楸┧岷碗p丙烯酸，這一脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化 的，故應(yīng)核實(shí)溶液的pH值不超過7.0。這一溶液置棕色瓶中貯存于室 溫，每隔幾個(gè)月須重新配制。小心：丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并容易吸附于 皮膚。（2）十二烷基硫酸鈉（SDS）。SDS可用去離子水配成10% （w/v）貯存液保存于室溫。（3）用于制備分離膠和積層膠的Tris緩沖液。（4

14、）TEMED（N,N,N，N -四甲基乙二胺。TEMED通過催化過硫酸 銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。（5）過硫酸銨。過硫酸銨提供驅(qū)動丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合 所必需的自由基。須新鮮配制。（6）1.5M Tris，pH8.8 （分離膠緩沖液）（7）1M Tris，pH6.8 （濃縮膠緩沖液）（8）Tris-甘氨酸電泳緩沖液。25mM Tris，250mM 甘氨酸（pH 8.3, 0.1% SDS，（9 樣品處理液，50mM Tris-HCl（pH 6.8, 100mM DTT（or 5% 巰 基乙醇，2% SDS，0.1%漠酚藍(lán)，10%甘油（10）染色液：0.1%考馬斯亮藍(lán)R2

15、50，40%甲醇，10%冰醋酸（11）脫色液：10%甲醇，10%冰醋酸四、實(shí)驗(yàn)步驟配制SDS聚丙烯酰胺凝膠所需的各種試劑SDS聚丙烯酰胺凝膠的灌制（realplay）根據(jù)廠家說明書安裝玻璃板。確定所需凝膠溶液體積，按下表給出的數(shù)值在一小燒杯中按所 需丙烯酰胺濃度配制一定體積的分離膠溶液。一旦加入TEMED，馬上開 始聚合，故應(yīng)立即快速旋動混合物并進(jìn)入下步操作。配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠溶液溶液成分總體積5ml總體積10ml總體積15ml總體積 20ml總體積25ml總體積30ml6%水2.6ml5.3ml7.9ml10.6ml13.2ml15.9ml30%丙烯酰胺1.0

16、ml2.0ml3.0ml4.0ml5.0ml6.0ml1.5MTris(pH8.81.3ml2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5ml10% SDS0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3ml10%過硫酸胺0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3mlTEMED0.004ml0.008ml0.012ml0.016ml0.02ml0.024ml-IU8I0 .0 IWO .0 I房.0 -mgz .0 I房.0 -mgz .0 egL i房.9 WO00M .9 IS6.M eg 二-InzIO .0 W600 .0 W900 .0 wz .0

17、-mgl .0 2 .0 wz .0 -mgl .0 2 .0 WO .g W8.8 言.z I房.g WO .寸 M .z I房.6 日6.9 日9 .寸 -房。0 .0 WWI ego .0BWM劃 koi ego .0 SQS w8 .8Hd)SI占 I 房二 s 二 i 房.1I房.z 泊-IU6 .6 MIO .0I房.0 I房.0 言L WO .01 IS6 二WZ .820 .0-mgz .0-mgz .0I房.9 I房.8 IS6 .6W9 .9W800 .0WZ .0WZ .0wo .gM .9IS6 LW6 .寸 W900 .0 -w .0 -w .0 W8 .8 WO .

18、g IS6 .gI房.8 Moo .0 2 .0 2 .0 言.z I房.8 w。.寸W9 .1Imzoo .0 ego .0 ego .0 i房.1 m .1 IS6 二WSMI-SQS w 8 .8Hd)SI占s .1 蠱蓋簍KKOE30%丙烯酰胺2.0ml4.0ml6.0ml8.0ml10.0ml12.0ml1.5MTris(pH8.81.3ml2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5ml10% SDS0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3ml10%過硫酸胺0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3mlTEMED0.002ml0.004m

19、l0.006ml0.008ml0.01ml0.012ml15%水1.1ml2.3ml3.4ml4.6ml5.7ml6.9ml30%丙烯酰胺2.5ml5.0ml7.5ml10.0ml12.5ml15.0ml1.5MTris(pH8.81.3ml2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5ml10% SDS0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3ml10%過硫酸胺0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3mlTEMED0.002ml0.004ml0.006ml0.008ml0.01ml0.012ml迅速在兩玻璃板的間隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注濃縮膠所

20、 需空間（梳子的齒長再加0.5cm。再在膠液面上小心注入一層水（約 23mm高），以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液。分離膠聚合完全后（約30分鐘），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸 凈殘留水。制備濃縮膠：按下表給出的數(shù)據(jù)，在另一小燒杯中制備一定體 積及一定濃度的丙烯酰胺溶液，一旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應(yīng) 立即快速旋動混合物并進(jìn)入下步操作。配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳5%濃縮膠溶液溶液成分總體積3ml總體積4ml總體積 5ml總體積 6ml總體積 8ml水2.1ml2.7ml3.4ml4.1ml5.5ml30%丙烯酰胺0.5ml0.67ml0.83ml1.0ml1.3ml1M Tris(

21、pH6.80.38ml0.5ml0.63ml0.75ml1.0ml10% SDS0.03ml0.04ml0.05ml0.06ml0.08ml10%過硫酸胺0.03ml0.04ml0.05ml0.06ml0.08mlTEMED0.003ml0.004ml0.005ml0.006ml0.008ml聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠，立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳 子。小心避免混入氣泡，再加入濃縮膠溶液以充滿梳子之間的空隙， 將凝膠垂直放置于室溫下。在等待濃縮膠聚合時(shí)，可對樣品進(jìn)行處理，在樣品中按1：1體積比 加入樣品處理液，在100C加熱3分鐘以使蛋白質(zhì)變性。濃縮膠聚合完全后（30分鐘），小心移出梳子。

22、把凝膠固定于電泳 裝置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸電極緩沖液。必須設(shè)法排出凝膠底 部兩玻璃板之間的氣泡。按予定順序加樣，加樣量通常為1025ul（1.5mm厚的膠）。將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為8V/cm。當(dāng)染料前沿進(jìn)入 分離膠后，把電壓提高到15V/cm，繼續(xù)電泳直至漠酚藍(lán)到達(dá)分離膠底 部上方約1cm，然后關(guān)閉電源。(11)從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮勺撬開玻璃板。緊靠最左邊一孔 (第一槽)凝膠下部切去一角以標(biāo)注凝膠的方位。用考馬斯亮藍(lán)對SDS聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行染色經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)樣品可用考馬斯亮藍(lán)R250染 色。染色12小時(shí)或過夜。換脫色液脫色，需310

23、小時(shí)，其間更換多次脫色液至背景清楚。此方法檢測靈敏度為0.21.0mg。脫色后，可將凝膠浸于水中，長 期封裝在塑料袋內(nèi)而不降低染色強(qiáng)度。為永久性記錄，可對凝膠進(jìn)行 拍照，或?qū)⒛z干燥成膠片。聚丙烯酰胺凝膠電泳原理及方法五、結(jié)果處理測量并計(jì)算分子量蛋白質(zhì)的分子量與它的電泳遷移有一定關(guān)系式，經(jīng)37種蛋白的測定得 到以下的關(guān)系式：Mw =K (10 一bm(1lgMw = lg K bm =K1 bm(2其中Mw是蛋白質(zhì)分子量；K和K1為常數(shù)b為斜率，m是電泳遷移率，實(shí)際使用的是相對遷移率mR。如果用幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)作縱坐標(biāo)，用各自的相對遷移 率作橫坐標(biāo)，即可畫出一條斜率為負(fù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。相對遷移率為：其中，dpr、dBPB分別為樣品和BPB （漠酚蘭）以分離膠表面為 起點(diǎn)遷移的距離。欲求未知蛋白的分子量，只需求出它的相對遷移率：mR 未二dpr 未/dBPB然后，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上就可求出此未