DB15T 2725-2022 規(guī)模化牛場細(xì)菌性腹瀉防控技術(shù)規(guī)范

1、ICS65.020.30CCSB 4115內(nèi) 蒙 古 自 治 區(qū) 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB15/T 27252022規(guī)?；黾?xì)菌性腹瀉防控技術(shù)規(guī)范Technical specification for bacterial diarrhea prevention and control in large-scale cattle farms2022-07-29 發(fā)布2022-08-29 實施內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā) 布DB15/T 27252022前言本文件按照GB/T 1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（SA

2、M/TC 19）歸口。本文件起草單位：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)、內(nèi)蒙古自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心、金宇保靈生物藥品有限公司、內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團(tuán)股份有限公司、北京生泰爾科技股份有限公司。本文件主要起草人：徐曉靜、王建龍、謝夢圓、王秀敏、魏小軍、趙曉軍、吳曉亮、張志丹、陳堅、韓四娥、黃海碧、王旭紅、秀英、杜鵬。IDB15/T 27252022DB15/T 27252022革蘭染色陰性桿菌，大小為0.4 m0.7 m2 m3 m，兩端鈍圓。沙門菌革蘭染色陰性桿菌，大小為0.7 m1.5 m2 m5 m。副結(jié)核分枝桿菌革蘭染色陽性短桿菌，大小為0.2 m0.5 m0.5 m1.5 m，抗酸染色紅色。規(guī)?；黾?xì)

3、菌性腹瀉防控技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了規(guī)?；黾?xì)菌性腹瀉的診斷和防治。本文件適用于奶牛飼養(yǎng)場（戶）、肉牛飼養(yǎng)場（戶）和動物診療機(jī)構(gòu)對致病性大腸桿菌、沙門菌、副結(jié)核分枝桿菌引起牛腹瀉疾病的防控。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件， 僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB 4789.4 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗GB 4789.6 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗GB/T 16568 奶牛場衛(wèi)生規(guī)范GB/T 27401 實驗室

4、質(zhì)量控制規(guī)范 動物檢疫GB/T 27637 副結(jié)核分枝桿菌實時熒光PCR檢測方法NY 5047 無公害食品 奶牛飼養(yǎng)獸醫(yī)防疫準(zhǔn)則NY/T 5049 無公害食品 奶牛飼養(yǎng)管理準(zhǔn)則3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。細(xì)菌性腹瀉 （bacterial diarrhea）由細(xì)菌性病原引起，以腹瀉為主要癥狀的常見腸道傳染病。犢牛大腸桿菌性腹瀉又稱為犢白痢，沙門菌病又稱為犢牛副傷寒，副結(jié)核分枝桿菌引起的腹瀉又稱為副結(jié)核性腸炎。4 生物安全措施樣品處理的生物安全措施符合GB 19489的規(guī)定。樣品采集的生物安全措施符合GB/T 27401的規(guī)定。5 病 原致病性大腸桿菌1GB 19489 實驗室 生物

5、安全通用要求6 診 斷 臨床診斷流行病學(xué)不同年齡和品種牛均可感染，幼齡牛易感，犢白痢多發(fā)于 1月齡內(nèi)犢牛；犢牛副傷寒多發(fā)于15月齡的犢牛；副結(jié)核性腸炎多發(fā)于成年牛。病牛和帶菌牛是本病自然流行的傳染源，隨糞便排出大量病原菌，污染外界環(huán)境。消化道是最主要的傳播途徑。一年四季均可發(fā)生，尤以氣候多變、寒冷季節(jié)好環(huán)境衛(wèi)生較差時多發(fā)。臨床癥狀犢白痢牛初期體溫升高達(dá)41 42 ，有的犢牛出生后數(shù)小時開始腹瀉。初期糞便呈粥樣、白色或黃白色，后期呈水樣、灰白色，混有未消化的凝乳塊、血液及泡沫，有酸臭味。末期患病牛伴有腹痛，用蹄踢腹壁?？砂l(fā)生臍炎或關(guān)節(jié)炎，偶見肺炎。耐過病牛發(fā)育遲緩。有時可見神經(jīng)癥狀，興奮不安，有

6、些病例可突然死亡。犢牛副傷寒主要由鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌引起。犢牛多發(fā)病突然，病初體溫升高至40 41 ，24 h后排出灰黃色稀便，混有黏液和血絲，一般于出現(xiàn)癥狀后5 d7 d內(nèi)死亡。病程長者可能會出現(xiàn)腕關(guān)節(jié)和跗關(guān)節(jié)腫大。成年牛感染表現(xiàn)高熱、昏迷、食欲廢絕、呼吸困難，發(fā)病后12 h24 h糞便中帶有血塊，隨即腹瀉。糞便惡臭，含有纖維素絮片。病牛常死于高熱期后。病程長者可見脫水、消瘦、眼窩下陷，黏膜充血發(fā)黃。妊牛多流產(chǎn)。副結(jié)核性腸炎潛伏期較長，一般多見于25歲成年牛，發(fā)病初期為間歇性腹瀉，逐漸變?yōu)轭B固性腹瀉，腹瀉呈噴射狀水樣便，排泄物稀薄、惡臭，帶有氣泡、黏液。體溫常無變化，病程長者可見顯著消

7、瘦，皮下水腫。病理變化犢白痢剖檢可見皺胃和小腸黏膜充血、水腫和出血，皺胃內(nèi)有大量凝乳塊，黏膜表面覆蓋膠狀黏液。腸內(nèi)容物常混有血液和氣泡，惡臭。腸系膜淋巴結(jié)腫大。經(jīng)臍帶感染的病例可見出血性臍炎和出血性臍動脈炎。病程長者伴有漿液纖維素性關(guān)節(jié)炎和出血性或漿液出血性肺炎。突然死亡的病例常無明顯病理變化。2犢牛副傷寒剖檢可見腸內(nèi)容物稀薄，混有黏液和血液，呈咖啡色。病程較長時，小腸可見浮膜性與固膜性腸炎， 腸系膜淋巴結(jié)呈不同程度的水腫、出血。皺胃黏膜充血、水腫，表面被覆大量黏液，有時可見出血點。脾臟明顯腫大而柔軟，呈灰紅或暗紅色，邊緣鈍圓，被膜緊張，可見出血斑點和粟粒大的壞死灶。肝臟腫大，質(zhì)地柔軟，被膜下

8、散在針尖大的灰黃或灰白色病灶。副結(jié)核性腸炎剖檢可見尸體極度消瘦，可視黏膜因貧血呈蒼白色，被毛粗亂無光。特征性病變?yōu)槁栽錾阅c炎及相應(yīng)的淋巴結(jié)炎。病變多集中于空腸、回腸和結(jié)腸前段。病變腸管變粗，腸腔狹窄，黏膜覆蓋一層灰白色黏稠的糊狀物。腸黏膜增厚230倍，折疊形成腦回樣皺襞。病變部腸管的漿膜淋巴管和相應(yīng)的腸系膜淋巴管擴(kuò)張、增粗，呈彎曲的細(xì)繩索狀，腸系膜淋巴結(jié)腫脹。結(jié)果判定符合6.1.1、6.1.2、6.1.3，可判定為牛細(xì)菌性腹瀉疑似病例。 實驗室診斷主要儀器設(shè)備37 恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、PCR 儀、PCR 管、電泳儀、凝膠成像儀。主要試劑生理鹽水、細(xì)菌微量生化反應(yīng)管及指示劑、Taq

9、酶、TAE 電泳緩沖液、DNA Marker。樣品采集糞便樣品將棉拭子伸入肛門內(nèi)刮取新鮮糞便，也可無菌采集地上剛排出新鮮糞便。分別放入裝有3 mL高壓滅菌的生理鹽水采樣管中，編號并記錄相關(guān)信息。組織樣品取病死牛腸道、肝、脾、淋巴結(jié)、胃、臍帶等，置于無菌密封袋或采樣杯內(nèi)。病原檢測細(xì)菌培養(yǎng)大腸桿菌培養(yǎng)大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂上形成黑色帶金屬光澤的菌落；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成紅色菌落。沙門菌培養(yǎng)沙門菌在SS培養(yǎng)基上形成中心黑色的無色菌落；HE瓊脂培養(yǎng)基上形成藍(lán)綠色或藍(lán)色菌落，多數(shù)菌落中心黑色；去氧膽鹽鈉-枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上形成無色透明菌落。副結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)3DB15/T 27252022DB15/T

10、27252022副結(jié)核分枝桿菌初代分離困難，在病變腸段及腸淋巴結(jié)分離率較高，可先用4% H2SO4 或2% NaOH 處理，Dubods培養(yǎng)基上形成乳白色或米黃色不透明菌落；HEYM培養(yǎng)基上形成乳白色、光滑、邊緣整齊的菌落。染色鏡檢大腸桿菌革蘭染色挑取伊紅美藍(lán)瓊脂和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的大腸桿菌特征性菌落涂片，進(jìn)行革蘭染色，鏡下可觀察到粉紅色的桿菌。沙門菌革蘭染色挑取SS培養(yǎng)基、HE瓊脂培養(yǎng)基和去氧膽鹽鈉-枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上的沙門菌特征性菌落涂片，進(jìn)行革蘭染色，鏡下可觀察到粉紅色的桿菌。副結(jié)核分枝桿菌抗酸染色挑取Dubods 培養(yǎng)基和HEYM培養(yǎng)基上的副結(jié)核分枝桿菌特征性菌落涂片，進(jìn)行抗酸染色，鏡

11、下可觀察到紅色成叢、兩端鈍圓的桿菌。生化鑒定根據(jù)伯杰細(xì)菌手冊對細(xì)菌性病原進(jìn)行生化特性鑒定。大腸桿菌挑取單個菌落純培養(yǎng)后接種細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，進(jìn)行甲基紅試驗、吲哚（靛基質(zhì)）試驗、枸櫞酸鹽試驗、V-P試驗、硫化氫試驗、三糖鐵試驗、尿素酶試驗、糖類分解試驗（葡萄糖、乳糖、甘露糖、蔗糖）等。甲基紅試驗、吲哚試驗、葡萄糖和甘露糖發(fā)酵試驗結(jié)果呈陽性，枸櫞酸鹽試驗、V-P試驗、尿素酶試驗結(jié)果呈陰性，三糖鐵瓊脂斜面呈黃色、底層產(chǎn)氣，幾乎均不產(chǎn)生硫化氫，大多數(shù)菌株可迅速發(fā)酵乳糖，僅極少數(shù)遲發(fā)酵或不發(fā)酵，約半數(shù)菌株不分解蔗糖，符合以上生化反應(yīng)說明與大腸桿菌特性相符。也可用全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。沙門菌

12、挑取單個菌落純培養(yǎng)后接種細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，進(jìn)行甲基紅試驗、吲哚（靛基質(zhì)）試驗、枸櫞酸鹽試驗、V-P試驗、硫化氫試驗、三糖鐵試驗、糖類分解試驗（衛(wèi)矛醇、山梨醇、乳糖、棉子糖、蔗糖） 等。甲基紅試驗、枸櫞酸鹽試驗、衛(wèi)矛醇和山梨醇發(fā)酵試驗結(jié)果呈陽性，吲哚試驗、V-P試驗、乳糖、棉子糖、蔗糖分解試驗結(jié)果呈陰性，在三糖鐵瓊脂上常產(chǎn)生硫化氫，符合以上生化反應(yīng)說明與沙門菌特性相符。也可用全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。血清學(xué)鑒定致病性大腸桿菌血清學(xué)鑒定按照GB 4789.6對致病性大腸桿菌進(jìn)行血清學(xué)鑒定及結(jié)果判定。沙門菌血清學(xué)鑒定按照GB 4789.4對沙門菌進(jìn)行血清學(xué)鑒定及結(jié)果判定。4PCR 檢測DN

13、A 提取將采集的樣品進(jìn)行處理，按DNA提取試劑盒方法提取核酸。在-20 條件下可短時間保存，若需長期保存，應(yīng)置于-70 以下條件，避免反復(fù)凍融。致病性大腸桿菌 PCR 檢測按照GB 4789.6對致病性大腸桿菌進(jìn)行PCR檢測及結(jié)果判定。沙門菌 PCR 檢測根據(jù)沙門菌毒力基因inv A設(shè)計引物。參考李文豪論文“呼和浩特牛腹瀉部分細(xì)菌性病原檢測及三重PCR檢測方法的建立”中的引物序列：F：CACGCTCTTTCGTCTGGCATTA；R：TAGACAGGGCGGAGGACAAATC。25 L反應(yīng)體系配制：模板2 L，上下游引物各1 L，Taq 酶12.5 L，RNase-Free H2O 8.5

14、L。反應(yīng)參數(shù)：95 15 min；94 1 min，54 30 s，72 1 min，35個循環(huán)；72 10 min。電泳檢測樣品 PCR 產(chǎn)物片段長度為464 bp，即判定為沙門菌。副結(jié)核分枝桿菌 PCR 檢測按照GB/T 27637對副結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行PCR檢測及結(jié)果判定。 綜合診斷疑似符合6.1.1、6.1.2、6.1.3，可判定為牛細(xì)菌性腹瀉疑似病例。確診符合6.1.1、6.1.2、6.1.3，結(jié)合實驗室診斷（PCR檢測、血清學(xué)鑒定）結(jié)果為陽性，可判定為牛細(xì)菌性腹瀉確診病例。7 預(yù) 防加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，保持環(huán)境衛(wèi)生。按照 GB/T 16568 和 NY/T 5049 的規(guī)定 。加強(qiáng)產(chǎn)房消毒衛(wèi)生，產(chǎn)房需要保暖、寬敞、通風(fēng)、干燥，產(chǎn)犢過程中排出物及時清除，隨時消毒。保暖在保證舍內(nèi)溫度的前提下，自然通風(fēng)，保證牛舍干燥、舒適、溫暖。避免應(yīng)激，消除可能降低機(jī)體抵抗力的各種應(yīng)激因素。分娩時，落地犢?？诒乔形鸾佑|臟污。 初生犢牛及時哺喂初乳。犢牛出生后 1 h 內(nèi)灌服經(jīng)巴氏消毒的初乳 4 L，奶溫 36 38 ，12 h 后視情況可再飼喂 2 L。哺乳犢牛給予開食料，補(bǔ)充微量元素，飼料配比適當(dāng)。牛群防疫按照NY 5047 的規(guī)定。病死或死因不明牛按照病死及病害動物無害化處理技術(shù)規(guī)范及病死畜禽和病害畜禽產(chǎn)品無害化處理管理辦法的規(guī)定處理。8 治 療5抗菌藥物治療根