提RNA+逆轉(zhuǎn)錄+qRT-PCR步驟模板

1、.WD.WD.WD.【一、提RNA】一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：1、試劑：75%乙醇、Trizol、1.5mL 進(jìn)口EP管、氯仿、異丙醇、進(jìn)口槍頭(RNA專用)、2、配75%乙醇(DEPC水+無水乙醇)，放-20冰箱預(yù)冷；3、預(yù)冷離心機(jī)(1.5mL EP管用的)；4、清潔桌面，酒精噴過之后擦干，新手套、兩層口罩；二、操作步驟：01、棄上清不回收，直接倒去；02、1mL/孔 PBS洗兩遍不回收，直接倒去，隨后用200L槍吸盡PBS；03、每孔加500L Trizol，輕晃，隨后室溫放置2min左右；04、槍頭吹打，吸出放入1.5mL 進(jìn)口EP管；05、參加100L氯仿(即1/5體積的trizol)；06、4離

2、心機(jī)，12000g，15min；07、吸200L(可減少)上清放入新的1.5mL 進(jìn)口EP管中注意：只能吸到上清；08、參加等體積異丙醇，充分混勻，常溫放置10-30min(15min)；09、4離心機(jī)，12000g，10min；10、倒掉液體，參加1mL預(yù)冷的75%乙醇劇烈混勻；11、4離心機(jī)，7500g，5min；12、倒掉上清，參加1mL預(yù)冷的75%乙醇，混勻；13、4離心機(jī)，7500g，5min；14、倒掉上清，倒扣在餐巾紙上，5-10min，用針頭或者200微升槍頭去掉管壁上的水珠；15、每管中參加40L(40-60L)的DEPC水，吹打溶解；16、測濃度先知樓21樓測RNA濃度，帶

3、DEPC水、滅菌的dd水、10微升槍和槍頭；三、本卷須知01、如果當(dāng)時(shí)不測RNA濃度，可暫時(shí)把RNA放在-20冰箱。但長時(shí)間(24h)保存，需要放在-80冰箱；02、異丙醇作用是沉淀RNA，作用比乙醇好；03、04、05、06、07、08、09、【二、測RNA濃度】一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：01、先知樓21樓-2109教室，一個(gè)冰盒+DEPC水+10微升槍、滅菌dd H2O、10L槍頭(RNA專用)、本子+筆；二、操作步驟：01、登記；02、翻開電腦=翻開“N軟件=點(diǎn)擊“Nucleic acid=選擇“OK=選擇“RNA；03、滅菌dd H2O清洗2-3遍，擦干；04、DEPC水 校零：即加DEPC水一滴

4、，點(diǎn)擊“Blank，擦干；05、測RNA：加樣品一滴，點(diǎn)擊“measure，擦干，隨后加下一個(gè)樣品；06、記錄數(shù)據(jù)，包括RNA濃度0.1。請注意，這個(gè)值跟儀器無關(guān)，核酸的吸光度必需大于 0.1，其值才有效和可靠，因?yàn)闃悠分械碾s質(zhì)和顆粒這些不純物的干擾通常會對光有一定吸收，其值0.1；2.A280nm、A270nm是 HYPERLINK :/cpro.baidu /cpro/ui/uijs.php?adclass=0&app_id=0&c=news&cf=1001&ch=0&di=8&fv=18&is_app=0&jk=3d10a9164843a066&k=%B5%B0%B0%D7&k0=%B5

5、%B0%B0%D7&kdi0=0&luki=6&mcpm=0&n=10&p=baidu&q=baidusiteerror_cpr&rb=0&rs=1&seller_id=1&sid=66a0434816a9103d&ssp2=1&stid=9&t=tpclicked3_hc&td=1615258&tu=u1615258&u= :/html/201305/5867686.html&urlid=0 t :/html/201305/_blank 蛋白最高吸收峰的吸收波長，比值可進(jìn)展 HYPERLINK :/cpro.baidu /cpro/ui/uijs.php?adclass=0&app_id=0

6、&c=news&cf=1001&ch=0&di=8&fv=18&is_app=0&jk=3d10a9164843a066&k=%BA%CB%CB%E1&k0=%BA%CB%CB%E1&kdi0=0&luki=8&mcpm=0&n=10&p=baidu&q=baidusiteerror_cpr&rb=0&rs=1&seller_id=1&sid=66a0434816a9103d&ssp2=1&stid=9&t=tpclicked3_hc&td=1615258&tu=u1615258&u= :/html/201305/5867686.html&urlid=0 t :/html/201305/_bl

7、ank 核酸樣品純度評估：純 DNA 的 A260/A280比值為1.8，純RNA為2.0。如果比值低，表示受到蛋白芳香族或酚類物質(zhì)的污染，需要純化樣品。比值=1.5 相當(dāng)于50 HYPERLINK :/cpro.baidu /cpro/ui/uijs.php?adclass=0&app_id=0&c=news&cf=1001&ch=0&di=8&fv=18&is_app=0&jk=3d10a9164843a066&k=%B5%B0%B0%D7%D6%CA&k0=%B5%B0%B0%D7%D6%CA&kdi0=0&luki=2&mcpm=0&n=10&p=baidu&q=baidusiteer

8、ror_cpr&rb=0&rs=1&seller_id=1&sid=66a0434816a9103d&ssp2=1&stid=9&t=tpclicked3_hc&td=1615258&tu=u1615258&u= :/html/201305/5867686.html&urlid=0 t :/html/201305/_blank 蛋白質(zhì)/DNA溶液.酚的最大吸收峰在270nm。3. A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長，比值可進(jìn)展核酸樣品純度評估：純DNA 和 RNA的A260/A230比值為2.5。假設(shè)比值小于2.0 標(biāo)明樣品被碳水化合物糖類、鹽類或有機(jī)溶劑污染，需要純化樣品。A230

9、產(chǎn)生負(fù)值主要是由于在很低 DNA 濃度的溶液中的一些其他成分的干擾所導(dǎo)致的。在下一個(gè)測定中，需要降低樣品的稀釋度，A230的負(fù)值會被校正。4. A320nm或A340nm 為檢測溶液樣品的濁度和其他干擾因子。該值應(yīng)該接近0.0。如果不是，標(biāo)明溶液中有懸浮物，需要 HYPERLINK :/cpro.baidu /cpro/ui/uijs.php?adclass=0&app_id=0&c=news&cf=1001&ch=0&di=8&fv=18&is_app=0&jk=3d10a9164843a066&k=%B4%BF%BB%AF&k0=%B4%BF%BB%AF&kdi0=0&luki=1&mcp

10、m=0&n=10&p=baidu&q=baidusiteerror_cpr&rb=0&rs=1&seller_id=1&sid=66a0434816a9103d&ssp2=1&stid=9&t=tpclicked3_hc&td=1615258&tu=u1615258&u= :/html/201305/5867686.html&urlid=0 t :/html/201305/_blank 純化樣品。純樣品的A320一般是0。5. A260/A280和A260/A230 是 HYPERLINK :/cpro.baidu /cpro/ui/uijs.php?adclass=0&app_id=0&c=

11、news&cf=1001&ch=0&di=8&fv=18&is_app=0&jk=3d10a9164843a066&k=%BA%CB%CB%E1&k0=%BA%CB%CB%E1&kdi0=0&luki=8&mcpm=0&n=10&p=baidu&q=baidusiteerror_cpr&rb=0&rs=1&seller_id=1&sid=66a0434816a9103d&ssp2=1&stid=9&t=tpclicked3_hc&td=1615258&tu=u1615258&u= :/html/201305/5867686.html&urlid=0 t :/html/201305/_blank

12、 核酸純度的指示值。純度好的DNA或RNA，在pH7-8.5 下A260 / A280的比值應(yīng)該在2.0 或2.5。純潔的樣品比值大于1.8DNA或者2.0RNA。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如 HYPERLINK :/cpro.baidu /cpro/ui/uijs.php?adclass=0&app_id=0&c=news&cf=1001&ch=0&di=8&fv=18&is_app=0&jk=3d10a9164843a066&k=%CC%BC%CB%AE%BB%AF%BA%CF%CE%EF&k0=%CC%BC%CB%

13、AE%BB%AF%BA%CF%CE%EF&kdi0=0&luki=4&mcpm=0&n=10&p=baidu&q=baidusiteerror_cpr&rb=0&rs=1&seller_id=1&sid=66a0434816a9103d&ssp2=1&stid=9&t=tpclicked3_hc&td=1615258&tu=u1615258&u= :/html/201305/5867686.html&urlid=0 t :/html/201305/_blank 碳水化合物、鹽胍鹽等，較純潔的核酸A260/A230的比值大于2.0。當(dāng)0.5BSA HYPERLINK :/cpro.baidu /

14、cpro/ui/uijs.php?adclass=0&app_id=0&c=news&cf=1001&ch=0&di=8&fv=18&is_app=0&jk=3d10a9164843a066&k=%B5%B0%B0%D7%D6%CA&k0=%B5%B0%B0%D7%D6%CA&kdi0=0&luki=2&mcpm=0&n=10&p=baidu&q=baidusiteerror_cpr&rb=0&rs=1&seller_id=1&sid=66a0434816a9103d&ssp2=1&stid=9&t=tpclicked3_hc&td=1615258&tu=u1615258&u= :/html/

15、201305/5867686.html&urlid=0 t :/html/201305/_blank 蛋白質(zhì)污染時(shí)，蛋白污染會導(dǎo)致260和280的數(shù)值都下降，其凈結(jié)果是260/280比值下降，但260/280的比值變化并不顯著，正如 HYPERLINK :/cpro.baidu /cpro/ui/uijs.php?adclass=0&app_id=0&c=news&cf=1001&ch=0&di=8&fv=18&is_app=0&jk=3d10a9164843a066&k=%B7%D6%D7%D3&k0=%B7%D6%D7%D3&kdi0=0&luki=3&mcpm=0&n=10&p=baid

16、u&q=baidusiteerror_cpr&rb=0&rs=1&seller_id=1&sid=66a0434816a9103d&ssp2=1&stid=9&t=tpclicked3_hc&td=1615258&tu=u1615258&u= :/html/201305/5867686.html&urlid=0 t :/html/201305/_blank 分子克隆3所說。但蛋白殘留會導(dǎo)致230的數(shù)值顯著上升，顯著影響260/230的比值。也就是說，如果RNA樣品的260/2801.7，260 /2300.5，那么就應(yīng)該考慮污染原因不是胍鹽殘留，而是蛋白殘留.用 HYPERLINK :/cpr

17、o.baidu /cpro/ui/uijs.php?adclass=0&app_id=0&c=news&cf=1001&ch=0&di=8&fv=18&is_app=0&jk=3d10a9164843a066&k=%B7%D6%B9%E2%B9%E2%B6%C8%BC%C6&k0=%B7%D6%B9%E2%B9%E2%B6%C8%BC%C6&kdi0=0&luki=5&mcpm=0&n=10&p=baidu&q=baidusiteerror_cpr&rb=0&rs=1&seller_id=1&sid=66a0434816a9103d&ssp2=1&stid=9&t=tpclicked3_hc&

18、td=1615258&tu=u1615258&u= :/html/201305/5867686.html&urlid=0 t :/html/201305/_blank 分光光度計(jì)測量RNA時(shí)，用水而不是用TE 緩沖液稀釋RNA樣品會造成A260/A280比值下降。原因是低離子強(qiáng)度和低pH溶液會增加280 nm處的光吸收值。加氯仿離心后取上清的時(shí)候千萬不要貪多，那樣就很容易被蛋白污染，所以現(xiàn)在一般取400ul左右。6.當(dāng)260/230加1號試劑2L=加3號試劑(0.5L)=加4號試劑(0.5L)=加2號試劑(0.5L)=加RNA=離心=上機(jī)；02、上機(jī)：OPEN=點(diǎn)擊“User菜單下的“clx，

19、點(diǎn)擊“Accept=選擇“run下面的到“exp001 rt=修改體系“10L(默認(rèn)為25微升)=點(diǎn)擊“Start，進(jìn)入界面；03、37.0 15min=85.0 5s=4.0 60min；04、4冰箱保存；三、本卷須知01、加液盡量無氣泡，槍不要打到底；02、嚴(yán)格冰上操作，防止RNA降解；【qRT-PCR】一、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：01、試劑：Roche的SyBr Green(rox)02、1.5mL EP管、0.2mL EP管、96孔板/八連冠；10L、20L、100L、200L、2.5L、1000L槍；03、冰盒一個(gè)、Rox化凍(避光)、引物化凍GAPDH、cDNA、DEPC水；二、操作步驟：01、

20、 Rox 10L；+ dd H2O 6L；+ P1(F) 1 + P2(R) 1 + cDNA 2-20L體系02、計(jì)算：每個(gè)樣，X個(gè)抗體(至少包括GAPDH-內(nèi)參,還有目的)，三個(gè)副孔。 即如果六個(gè)樣，2個(gè)抗體(GAPDH,PLK1)，三個(gè)副孔。6*1*3=1820(PLK1)，6*1*3=1820(GAPDH)；1234567891011126/PLK16/PLK16/PLK15/PLK15/PLK15/PLK16/GAP6/GAP6/GAP5/GAP5/GAP5/GAP4/PLK14/PLK14/PLK13/PLK13/PLK13/PLK12/PLK12/PLK12/PLK11/PLK1

21、1/PLK11/PLK14/GAP4/GAP4/GAP3/GAP3/GAP3/GAP2/GAP2/GAP2/GAP1/GAP1/GAP1/GAP PLK1 Rox：10*20=200L DEPC水：6*20=120L F：1*20=20L R：1*20=20L GAPDH Rox：10*20=200L DEPC水：6*20=120L F：1*20=20L R：1*20=20L03、稀釋cDNA 10倍(18L DEPC水+2L)=配置Mix(Rox+ DEPC水+F+R)=加樣(一橫排先加18L mix(GAPDH)，隨后參加18L mix(PLK1)。 隨后六個(gè)孔加同一個(gè)cDNA；06、去除

22、氣泡：加好樣后，觀察有無氣泡。如果有氣泡，彈開，隨后2000rpm離心，時(shí)間不定(5s即可)；07、上機(jī)+設(shè)置程序： A、雙擊翻開程序“StepOne Software v2.1 =點(diǎn)擊“ OK =點(diǎn)擊“Ignore & Continue Startup =點(diǎn)擊“Advanced Setup =進(jìn)入“ Experment Properties界面 ；B、Experment Properties界面： 將Expriment Name從Untitled 修改為“日期，如2015-12-17，將User Name(Optional)修改為“CZL；Which instrument are you u

23、sing to run the experiment ?中選擇“96 wells，一般無需修改；What type of experiment do you want to setup ?中選擇“Quantitation-Comparative CT(CT)；Which reagents do you want to use to detect the target sequence ? 中選擇“SYBR Green Reagents； Which ramp speed do you want to use in the instrument run ? 中選擇“Fast( 40 minutes to complete a run)；C、Plate Setup界面-Define Targets and Samples界面： Define Targets欄中：如果有GAPDH、PLK1、Akt、PI3K三個(gè)引物，那么點(diǎn)擊“Add New Target 三下，出現(xiàn)“Target1、Target2、Targ