第十五部分基因工程15GeneticEngineering教學(xué)課件

1、第十五部分基因工程15GeneticEngineering教學(xué)課件基因重組(gene recombination)是指DNA片段在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間，甚至在不同物種之間進(jìn)行交換，交換后的片段仍然具有復(fù)制和表達(dá)的功能。 基因工程(genetic engineering）是指采用人工方法將不同來源的DNA進(jìn)行重組，并將重組后的DNA引入宿主細(xì)胞中進(jìn)行增殖或表達(dá)的過程，從而改變生物特性或創(chuàng)造新的生物類型的技術(shù)。整合:外來DNA侵入宿主細(xì)胞，并與宿主細(xì)胞DNA進(jìn)行重組，成為宿主細(xì)胞DNA的一部分，這一過程稱為整合。 整合后的外來DNA仍然可隨染色體DNA一起復(fù)制，并在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行表達(dá)，但也可在相當(dāng)長的

2、一段時間內(nèi)不表達(dá)。基因工程的操作過程主要由以下步驟組成：載體和目的基因的分離；載體和目的基因的切斷；載體和目的基因的重組；重組DNA的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增；重組DNA的篩選和鑒定。（一）載體：可以將目的基因運(yùn)載進(jìn)入細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的DNA分子?；蚬こ讨谐Ｓ玫妮d體(vector)主要包括質(zhì)粒(plasmid)、噬菌體(phage)和病毒(virus)三大類。這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因，并賦予一些新的功能，如有利于進(jìn)行篩選的標(biāo)志基因、單一的限制酶切點(diǎn)等。載體構(gòu)建的條件：1. 能在受體細(xì)胞中獨(dú)立復(fù)制。2. 分子量小，易于分離、純化、導(dǎo)入3. 有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。4. 有可供選擇的遺傳標(biāo)志。5.

3、 易于導(dǎo)入受體細(xì)胞。1質(zhì)粒： 是存在于天然細(xì)菌體內(nèi)的一種獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外的雙鏈環(huán)狀DNA，具有獨(dú)立復(fù)制的能力，通常帶有細(xì)菌的抗藥基因。 最早使用的質(zhì)粒DNA是人工構(gòu)建的pBR322，該質(zhì)粒分子大小為4.3kb，帶有抗四環(huán)素和抗氨芐青霉素基因，含EcoR，BamH，Hind等單一的限制酶切點(diǎn)。 質(zhì)粒pUC19的分子結(jié)構(gòu)2噬菌體： l可通過轉(zhuǎn)染方式將其DNA送入細(xì)菌體內(nèi)進(jìn)行增殖。常用的為人工構(gòu)建的噬菌體載體。噬菌體兩端的片段對于其包裝是必需的，因而應(yīng)予保留；而其中間部分則可進(jìn)行改造或置換，使之具有某種單一的限制酶切點(diǎn)。目的基因與噬菌體DNA進(jìn)行重組時，可采用插入重組方式，也可采用置換重組方式。

4、 3病毒： 常用的為SV40，通過感染方式將其DNA送入哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行增殖。目前應(yīng)用相對較少。（二）目的基因： 目的基因的篩選和分離可采用以下方法進(jìn)行： 1直接從染色體DNA中分離：僅適用于原核生物基因的分離，較少采用。 2人工合成： 根據(jù)已知多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進(jìn)行人工合成。適應(yīng)于編碼小分子多肽的基因。l采用一定的方法釣取特定基因的mRNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成其互補(bǔ)DNA（cDNA），除去RNA鏈后，再用DNA聚合酶合成其互補(bǔ)DNA鏈，從而得到雙鏈DNA。這一方法通?？傻玫娇杀磉_(dá)的完整基因。 3從mRNA合成cDNA： 4從基因文庫中篩選： 將某一種基

5、因DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗪?，與載體DNA重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部基因組DNA的種群，稱為G文庫(genomic DNA library)。 將某種細(xì)胞的全部mRNA通過逆轉(zhuǎn)合成cDNA，然后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部表達(dá)基因的種群，稱為C-文庫(cDNA library)。C-文庫具有組織細(xì)胞特異性?；蚪M文庫的制作5利用PCR合成： l如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)，在體外合成目的基因。但此法可能會造成克隆的目的基因堿基序列的改變。 二、載體和目的基因的切斷： 通常采用限制性核酸內(nèi)切酶(restri

6、ction endonuclease)，簡稱限制酶，分別對載體DNA和目的基因進(jìn)行切斷，以便于重組。限制酶目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)400多種，所識別的順序往往為4-8個堿基對，且有回文結(jié)構(gòu)。 由限制酶切斷后的末端可形成平端、3-突出粘性末端和5-突出粘性末端三種情況。形成粘性末端(cohesive end)者較有利于載體DNA和目的基因的重組。三、載體和目的基因的重組（接） 即將帶有切口的載體與所獲得的目的基因連接起來，得到重新組合后的DNA分子。（一）粘性末端連接法：當(dāng)載體DNA和目的基因均用同一種限制酶進(jìn)行切斷時，二者即可帶有相同的粘性末端。如將載體與目的基因混合在一起，二者即可通過粘性末端進(jìn)行互補(bǔ)粘

7、合，再加入DNA連接酶，即可封閉其缺口，得到重組體。 較少的情況下，對產(chǎn)生的平端也可直接進(jìn)行連接。 載體DNA與目的基因的連接 （二）人工接尾法： 即同聚物加尾連接法。當(dāng)載體和目的基因無法采用同一種限制酶進(jìn)行切斷，無法得到相同得粘性末端時，可采用此方法。 此法首先使用單鏈核酸酶將粘性末端切平，再在末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，將脫氧核糖核苷酸添加于載體或目的基因的3-端，如載體上添加一段polyG，則可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通過堿基互補(bǔ)進(jìn)行粘合，再由DNA連接酶連接。 四、重組DNA的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增（轉(zhuǎn)） 重組DNA需導(dǎo)入宿主細(xì)胞才能進(jìn)行增殖或表達(dá)。重組質(zhì)?？赏ㄟ^轉(zhuǎn)化（transf

8、ormation）方式導(dǎo)入宿主細(xì)胞，即將大腸桿菌用CaCl2處理，增加細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性，再與重組質(zhì)粒DNA短暫溫育，質(zhì)粒DNA即可導(dǎo)入宿主細(xì)胞。如果是用噬菌體作為載體的重組體，則需要用外殼蛋白進(jìn)行包裝，使之成為具有感染能力的噬菌體，再通過轉(zhuǎn)染(transfection)方式將重組噬菌體DNA導(dǎo)入大腸桿菌等宿主細(xì)胞。 重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，即可在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)以擴(kuò)增宿主細(xì)胞。對于質(zhì)粒DNA，還可通過在培養(yǎng)基中加入氯霉素，抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成及染色體DNA的復(fù)制，以單獨(dú)擴(kuò)增細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA。五、重組DNA的篩選和鑒定（篩） 由于重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的比例通常較低，因此需要對含有重組體

9、的宿主細(xì)胞進(jìn)行篩選并作鑒定。可采用以下方法進(jìn)行：（一）根據(jù)重組體的表型進(jìn)行篩選： 對于帶有抗藥基因的質(zhì)粒重組體，可采用插入滅活法進(jìn)行篩選。如pBR322中帶有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素基因，當(dāng)將目的基因插入抗四環(huán)素基因后，就可引起該基因失活，細(xì)菌對氨芐青霉素耐藥，而對四環(huán)素敏感。在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能夠生長，而在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能生長的細(xì)菌即為帶重組體的細(xì)菌。 插入滅活法篩選重組體 （二）根據(jù)標(biāo)志互補(bǔ)進(jìn)行篩選： 當(dāng)宿主細(xì)胞存在某種基因及其表達(dá)產(chǎn)物的缺陷時，可采用此方法篩選重組體。即在載體DNA分子中插入相應(yīng)的缺陷基因，如宿主細(xì)胞重新獲得缺陷基因的表達(dá)產(chǎn)物，則說明該細(xì)胞中帶有重組體。（三）根據(jù)DNA限制酶譜進(jìn)行分析： 經(jīng)過粗篩后的含重組體的細(xì)菌，還需進(jìn)行限制酶譜分析進(jìn)一步鑒定。將單一細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增后分別提取其DNA，用重組時所用的同一限制酶進(jìn)行酶切，再將其與不含目的基因的載