臨床免疫學(xué)與檢驗：第三章 免疫原和抗血清的制備

1、2022/8/71第三章 免疫原和抗血清的制備2022/8/72第一節(jié) 免疫原的制備 免疫原是能誘導(dǎo)機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體和致敏淋巴細(xì)胞的抗原。 一、顆粒性抗原的制備 二、可溶性抗原的制備和純化 三、人工抗原的制備 2022/8/73一、顆粒性免疫原的制備天然的顆粒性免疫原主要是指人、動物或寄生蟲的細(xì)胞以及細(xì)菌抗原等，制備方法相對較簡單。 綿羊紅細(xì)胞的制備 細(xì)菌免疫原的制備2022/8/741.綿羊紅細(xì)胞的制備綿羊紅細(xì)胞是制備溶血素的免疫原，制備方法是采集健康綿羊的靜脈血，立即注入無菌帶有玻璃珠的三角燒瓶內(nèi)，充分搖動1520min，以除去纖維蛋白，即得抗凝綿羊全血。免疫動物前，取適量抗凝血

2、于離心管中，以無菌生理鹽水洗滌細(xì)胞3次（每次2000 rpm離心10min），然后取壓積紅細(xì)胞，稀釋成106/ml濃度的細(xì)胞懸液，即可應(yīng)用。2022/8/752.細(xì)菌免疫原的制備選用經(jīng)鑒定合格的標(biāo)準(zhǔn)菌株，接種于固體或液體培養(yǎng)基，置溫箱37培養(yǎng)24h增菌后處理。菌體抗原需要100水浴22.5h殺菌并破壞鞭毛抗原后應(yīng)用；而鞭毛抗原要用有動力的菌株，菌液用0.30.5甲醛處理；細(xì)菌毒素抗原則應(yīng)在殺菌后再加入0.51氯化鈣溶液方可使用。有些寄生蟲卵也可制成抗原懸液供免疫用。2022/8/76二、可溶性抗原的制備和純化（一）組織和細(xì)胞可溶性抗原的粗提（二）可溶性抗原的提取和純化（三）免疫球蛋白片斷的制備

3、2022/8/77 （一）組織和細(xì)胞抗原的粗提（1）組織勻漿的制備（2）細(xì)胞的破碎 反復(fù)凍融法 冷熱交替法 超聲破碎法 自溶法 溶菌酶處理法 表面活性劑處理法2022/8/78（二）可溶性抗原的提取純化 1超速離心法 2選擇性沉淀法 3. 層析法4電泳法 2022/8/791.超速離心和梯度密度離心法超速離心法 差速離心：低速與高速交替進行 密度梯度離心：屬區(qū)帶分離法，通過梯度密度來維持重力的穩(wěn)定性目前，僅用于少部分大分子抗原，如IgM、C1q、甲狀腺球蛋白等，以及一些比重較輕的抗原物質(zhì)如載脂蛋白A、B等的分離純化2022/8/7102.選擇性沉淀法（1）核酸沉淀劑法（2）鹽析沉淀法（3）有機

4、溶劑沉淀法（4）聚合物沉淀法2022/8/7114. 層析法（1）凝膠層析法：有名分子篩層析，是利用微孔凝膠將不同分子量的成分分離（2）離子交換層析：是利用一些帶離子基團的纖維素或凝膠，吸附交換帶相反電荷的蛋白質(zhì)抗原，將蛋白質(zhì)抗原按帶電荷不同或量的差異分成不同的組分（3）親和層析法：利用生物分子之間專一親合力的特異性和可逆性分離技術(shù)。2022/8/712（三）免疫球蛋白片斷的制備1.分離非共價鍵2.分離共價鍵3. 溴化氰裂解法4. 酶裂解法2022/8/7131分離非共價鍵肽鏈亞單位之間常為非共價鍵的結(jié)合，如氫鍵、疏水鍵及靜電引力等。這些鍵結(jié)合力較弱，可經(jīng)酸、堿、胍或脲等將其斷開制備片段。 2

5、022/8/7142分離共價鍵二硫鍵是連接免疫球蛋白的共價鍵，解離肽鏈間的二硫鍵可將輕鏈與重鏈分開。 2022/8/7153溴化氰裂解法溴化氰通過與蛋白質(zhì)中的甲硫氨酸側(cè)鏈的硫醚基起反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)酯。后者與水反應(yīng)，將肽鏈斷裂。2022/8/7164酶裂解法酶解法專一性較好，不良反應(yīng)少。不同的片段可用不同的酶進行裂解。如木瓜酶可將IgG 裂解成為兩個Fab 和一個Fc 片段，胃蛋白酶可將 IgG 裂解成為一個F(ab)2片段和幾個小肽段，胰蛋白酶則將IgG裂解成不規(guī)則的肽鏈。 2022/8/717(四) 純化抗原的鑒定常用的方法純度測定用聚丙烯酰胺凝膠電泳法、結(jié)晶法蛋白質(zhì)含量用雙縮脲法、紫外

6、光吸收法分子量測定免疫電泳法免疫活性用免疫雙擴散法2022/8/718三、人工抗原的制備人工抗原是指經(jīng)過人工修飾的半抗原性免疫原，例如多糖、多肽、甾體激素、脂肪胺、類脂質(zhì)、核酸以及化學(xué)物質(zhì)等。半抗原不能直接用作免疫原，只有把這些半抗原與蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)結(jié)合后，才能刺激機體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞。用于偶聯(lián)半抗原的大分子物質(zhì)稱為載體。2022/8/719三、人工抗原的制備人工結(jié)合抗原的制備人工合成抗原的制備基因工程抗原的制備 2022/8/720（一）人工結(jié)合抗原的制備2022/8/7211. 載體的選擇蛋白質(zhì)類：白蛋白多肽聚合物 ：多聚賴氨酸大分子聚合物 ：羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮2022

7、/8/7222.半抗原與載體的連接帶有游離氨基或游離羧基以及兩種基團都有的半抗原，可直接與載體連接。 帶有羥基、醛基、酮基的半抗原，如糖、多糖、醇、酚、核苷以及甾族激素等，不能直接與載體連接，需要用化學(xué)方法改造成羧基后才能與載體連接。 芳香族半抗原由于環(huán)上帶有羧基，它鄰位上的氫很活潑，極易取代。 2022/8/7233.半抗原性免疫原的鑒定半抗原與載體結(jié)合的數(shù)目與免疫原性相關(guān)。一般認(rèn)為至少要20個以上的半抗原分子連接到一個載體分子上，才能有效地產(chǎn)生抗體。當(dāng)半抗原與載體連接完成后，應(yīng)測定載體上所結(jié)合的半抗原量，常用吸收光譜分析法測定。2022/8/724（二）人工合成抗原的制備用化學(xué)方法可將活化

8、氨基酸聚合，使之成為多肽。同聚多肽、共聚多肽可根據(jù)蛋白質(zhì)抗原的免疫原性片段進行氨基酸序列分析，或由其編碼DNA推到出的氨基酸序列，構(gòu)建人工合成多肽抗原。2022/8/725（三）基因工程抗原的制備利用分子生物學(xué)技術(shù)，將編碼抗原氨基酸序列的基因克隆，并與適當(dāng)載體DNA連接，導(dǎo)入受體細(xì)胞，使之表達(dá)?？色@得具有免疫原性的重組蛋白，經(jīng)純化后可作為抗原（重組抗原），也稱為基因工程抗原。2022/8/726第二節(jié) 免疫佐劑免疫佐劑（immuno-adjuvant）是指同抗原一起或預(yù)先注射于機體，能夠增強機體免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)。簡稱佐劑。佐劑本身可以有免疫原性，也可以沒有免疫原性。2022/8

9、/727佐劑的種類具有免疫原性的佐劑：細(xì)胞因子、百日咳桿菌、卡介苗、細(xì)胞酰二肽等。無免疫原性的佐劑：氫氧化鋁、液體石蠟、羊毛脂、明礬、表面活性劑、脂質(zhì)體、多聚肌苷酸：胞苷酸等。2022/8/728常用佐劑 目前應(yīng)用最多的是福氏佐劑(Freunds adjuvant)。它是由液體石蠟、羊毛脂和卡介苗混合而成。福氏佐劑又可分為兩種：不完全福氏佐劑:是由液體石蠟與羊毛脂按15：1比例混合而成；福氏完全佐劑:在不完全佐劑中加卡介苗(終濃度為220mg/ml)，即成為完全福氏佐劑。在免疫動物時，應(yīng)先將福氏佐劑與抗原按1:1體積比混勻，制成 “油包水”乳化液。2022/8/729福氏（Freund）佐劑佐

10、劑Freund不完全佐劑=石蠟油+羊毛脂F(xiàn)reund完全佐劑=石蠟油+羊毛脂+卡介苗2022/8/730二、佐劑的作用機理 佐劑的作用可能機理：可以增加抗原的表面積和改變抗原活性基團構(gòu)型，從而增強抗原的免疫原性；佐劑與抗原混合可改變抗原的物理性狀，延長抗原在局部組織的貯存時間，使抗原緩慢釋放；刺激單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，增強其處理和提呈抗原的能力，刺激淋巴細(xì)胞增殖和分化，提高機體初次應(yīng)答和再次應(yīng)答的課題滴度。改變抗體產(chǎn)生的類型及誘導(dǎo)遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)。2022/8/731第三節(jié) 抗血清的制備一、動物的選擇：種群關(guān)系、動物的個體狀 況、抗原性質(zhì)、免疫血清用量合要求二、免疫方法：劑量、時間和途徑三、動物采

11、血法 1.頸動脈放血法 2.心臟采血法 3.靜脈多次采血法 2022/8/732第四節(jié) 免疫血清的純化由抗原免疫動物制備的免疫血清是成分復(fù)雜的混合物，除了含有特異性抗體外，還存在非特異性抗體和其他的血清成分。因此，在應(yīng)用抗血清前必須先行純化，以去除雜抗體防止血清中的其他成分干擾試驗結(jié)果。2022/8/733一、 特異性抗體的純化 1親和層析法：Sepharose 4B柱 2吸附法：雜抗原吸附雜抗體 2022/8/7341親和層析法將相應(yīng)的雜抗原交聯(lián)到Sepharose 4B上，裝柱后，將欲純化的免疫血清通過親和層析柱，使雜抗體吸附于柱上，洗脫液則為特異性抗體?？寡?022/8/7352吸附法

12、將雙功能試劑（如戊二醛）加入不含特異性抗原的雜抗原混合液（如血清、組織液或已知的某種雜抗原），制備成顆粒狀固相吸附劑。將此吸附劑直接加到免疫血清中（約110），使雜抗體和相應(yīng)抗原結(jié)合而去除。當(dāng)雜抗體較多時，必須處理兩次才能達(dá)到目的。2022/8/736二、IgG類抗體的純化 1鹽析法粗提球蛋白 2離子交換層析提取IgG ：DEAE 3親和層析法 2022/8/737第五節(jié) 抗血清的鑒定與保存抗血清的鑒定 抗體效價的測定 抗體特異性鑒定 抗體純度鑒定 抗體親和力鑒定 抗血清的保存2022/8/738一、抗血清的鑒定2022/8/739（一）抗體效價的測定 根據(jù)抗原性質(zhì)不同，可采取不同抗體效價測定

13、方法。顆粒性抗原可采用凝集試驗?？扇苄钥乖Ｓ妹庖唠p擴散法。2022/8/740抗原抗血清不稀釋 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128不稀釋1/81/161/321/64+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +表10-1 抗血清效價測定2022/8/741（二）抗體特異性鑒定抗體的特異性鑒定一般用特異性抗原及其相似的抗原與待鑒定抗體進行免疫雙擴散試驗。如果出現(xiàn)交叉反應(yīng)，說明有雜抗體存在?？蓱?yīng)用相應(yīng)抗原吸收雜抗體，即可得到單價特異性抗體。2022/8/742（三）抗體純度鑒定抗體的純度鑒定可采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法。若只出現(xiàn)一條蛋白電泳區(qū)帶說明抗體純化已達(dá)到要求，而出現(xiàn)多條蛋白區(qū)帶則表明抗血清中混有雜蛋白，必須進一步純化。2022/8/743（四）抗體親和力鑒定抗體的親和力（affinity）是指抗原與抗體結(jié)合的牢固程度。親和力關(guān)系到實驗方法的敏感性，是評價抗體質(zhì)量的重要指標(biāo)。抗體親和力大小常以親和常