免疫實驗課：雙向瓊脂擴散試驗

1、實驗、雙向瓊脂擴散試驗實驗目的：了解雙向瓊脂擴散的原理和用途。掌握抗體效價的測定方法。觀察抗原、抗體在瓊脂板中形成的沉淀線。可溶性抗原（如細菌浸出液、含菌病料浸出液、血清以及其他來源的蛋白質(zhì)、多糖質(zhì)、類脂體等）與其相應的抗體相遇后，在電解質(zhì)參與下，抗原抗體結合形成白色絮狀沉淀，出現(xiàn)白色沉淀線，此種現(xiàn)象稱為沉淀反應。沉淀反應中的抗原叫沉淀原（precipitinogen）,與沉淀原發(fā)生反應的抗體稱為沉淀素（precipitin）。沉淀反應主要包括有環(huán)狀沉淀反應、絮狀沉淀反應和瓊脂擴散反應。實驗原理 將可溶性抗原和抗體置于瓊脂凝膠板的對應孔中，兩者各自在凝膠中向四周自由擴散， 當抗原與抗體相遇，在

2、比例合適時形成可見的白色沉淀線。沉淀線的特征與抗原抗體的濃度、純度和擴散速率等有關。雙向瓊脂擴散試驗一種抗原抗體系統(tǒng)只出現(xiàn)一條沉淀帶根據(jù)沉淀帶出現(xiàn)的數(shù)目、位置以及相鄰二條沉淀帶之間的融合、交叉、分枝等情況，就可了解該復合抗原的組成。 免疫學及免疫學檢驗 A：Ag、Ab濃度及擴散率近似；B ： Ag、Ab濃度近似，擴散率Ag Ab ；C：Ag、Ab濃度近似，擴散率Ag Ab ；D： 擴散率近似，濃度Ag Ab ；E：濃度Ag Ab，擴散率Ag Ab ；F：濃度Ag Ab，擴散率Ag Ab沉淀線形狀、位置與抗原抗體擴散率及濃度的關系 免疫學及免疫學檢驗 (1) 沉淀線吻合：待檢抗原與標準抗原完全相

3、同。(2) 沉淀線相切：待檢抗原中含有與標準抗原相同的抗原，還含有另外的抗原與抗血清相對應。(3) 沉淀線相交：待檢抗原有與抗血清對應的抗原，但和標準抗原不同。(4) 沉淀線部分吻合：待測抗原和標準抗原性質(zhì)相同，但含量較低。A1：待檢抗原；A2：標準抗原抗體效價滴定 用梅花型孔，中間放抗原，周圍孔放下不同稀釋度的相應抗體，以出現(xiàn)沉淀線的最高稀釋倍數(shù)為該抗體的效價。 免疫學及免疫學檢驗材料與試劑1瓊脂粉2微量加樣器、打孔器、載玻片、濕盒、溫箱3. 抗原 健康人血清，用生理鹽水做1:5-1:40系列倍比稀釋5. 抗體 羊抗人IgG抗血清操作方法1稱取一定量的瓊脂粉，按1.5%（10-15g/L）的

4、比例加入生理鹽水，煮沸融化。2取一張潔凈干燥的載玻片，置于水平臺上，用吸管取充分混勻的抗體瓊脂液4ml澆于載玻片上，置于室溫冷卻凝固。制板要求布滿整張玻片，切均勻平整，厚薄一致無氣泡。3根據(jù)要求（孔徑即孔的直徑，孔距即兩孔圓心之間的距離，包括兩孔的半徑35mm）打成梅花形孔圖。4可用注射器針頭挑出孔中瓊脂?？滓蟠虻脠A而光滑，邊緣不能有破裂。5在火焰上緩緩加熱，使孔底邊緣的瓊脂少許熔化，以封底，以免加樣后液體從孔底滲漏。6吸取樣品加入孔內(nèi)(約10ul)，以加滿為度。中心孔加入抗體，周圍孔分別加入不同稀釋度的抗原。7擴散 將加樣的瓊脂凝膠板放在濕盒內(nèi)，置于37度，24h后觀察結果。若沉淀環(huán)不清晰

5、可用1%的鞣酸浸泡10min。結果判定用以檢測抗原或比較抗原差異時，將抗血清置中心孔，將待測抗原或需比較的抗原置于周圍相鄰孔。若出現(xiàn)沉淀帶完全融合，證明為同種抗原；若二者有部分相連，表明二者有共同抗原決定簇；若二條沉淀線相互交叉，說明二者抗原完全不同。1.雙擴散用于疾病診斷： 以IBD（炎性腸?。┰\斷為例，中心孔加IBD標準陽性血清，周圍孔分別加IBD標準抗原、生理鹽水、待檢抗原1.2.3.4。2.雙擴散用于抗體檢測： 以免疫雞IBD抗體檢測為例，中心孔加IBD標準抗原，周圍孔分別加IBD標準陽性血清.、 IBD陰性血清、待檢血清1.2.3.4。雙向免疫擴散的影響因素：1抗原、抗體因素1.1抗原、抗體的水溶解性1.2抗原的決定簇數(shù)量及分子量1.3抗體的單一性1.4抗原、抗體濃度和純度1.5 抗原、抗體的反應比例1.6抗原抗體反應的可逆性2瓊脂板因素2.1瓊脂的濃度、粘度2.2 pH值2.3電介質(zhì)2.4孔間距離2.5瓊脂板的厚度2.6其它（例：瓊脂板中的不溶性雜質(zhì)和礦物質(zhì)等對實驗的影響）3抗原抗體反應條件3.1反應溫度3.2空氣濕度3.3反應時間如果反應時間太短，抗原抗體擴散和反應不完