三代測序技術(shù)發(fā)展及其他精選課件

1、三代測序技術(shù)發(fā)展及它-LXF2019.4.101第1頁，共56頁。第一代測序技術(shù)原理：1.Sanger雙脫氧鏈終止法(Sanger,1977)2.MaxamGilbert DNA化學(xué)降解法(Maxam &Gilbert,1977)2第2頁，共56頁。Dideoxynucleotides（雙脫氧核苷酸） ddNTPs 是反應(yīng)終止劑可以當(dāng)作正常堿基參與復(fù)制，一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接。反應(yīng)體系中dNTPs的濃度遠(yuǎn)高于ddNTPs(一般3-4：1)。3第3頁，共56頁。Sanger雙脫氧終止法與 PCR反應(yīng)類似；反應(yīng)體系中包含：模板 DNA,Taq酶, dNTPs, ddNTPs和測序引

2、物；反應(yīng)過程： 變性復(fù)性延伸終止4第4頁，共56頁。Sanger第一步：加入復(fù)制終止劑5第5頁，共56頁。ddNTPs參與下的DNA復(fù)制Sanger法測序產(chǎn)物的平均鏈長取決于ddNTP：dNTP的比例,比例高時，得到較短的產(chǎn)物； （BigDye， HiDi）“標(biāo)記終止法”測序產(chǎn)物的平均長度可通過標(biāo)記反應(yīng)中dNTP濃度(高濃度能得到長的產(chǎn)物)或終止反應(yīng)的ddNTP:dNTP來調(diào)整。6第6頁，共56頁。Sanger第二步：熒光檢測7第7頁，共56頁。Gel ElectrophoresisDNA Fragment Size DeterminationDNA 帶負(fù)電DNA在電泳膠中的遷移率與其片段大小

3、有關(guān)8第8頁，共56頁。關(guān)于ABI3730 xl毛細(xì)管規(guī)格: 96道毛細(xì)管毛細(xì)管長度: 50cm凝膠的規(guī)格: POP-7液體分離膠配套的試劑: 基因測序(BigDye3.1v和5Sequence buffer) 基因分型(Liz120, Liz500, ROX500)基因測序及分型的運行時間 時間：96樣本 2h 通量：（94-96）/384*12讀長：700-900bp9第9頁，共56頁。長片段的測序Primer Walking：獲得未知克隆的序列信息，或者驗證克隆序列的準(zhǔn)確性。如果提供參考序列，可以一次完成長片段克隆的全長測序。Fragment1Fragment2Fragment3Frag

4、ment4Legend：PrimerFragment10第10頁，共56頁?；贏BI3730 xl平臺的擴展應(yīng)用1. Gene Synthesis：protein/DNA sequence of interestdesign oligosorder oligosRun 1st round PCR (assembly)Run 2nd round PCR (amplification)ligate into vector, transformPick colony and screen recombinants by colony PCRSequencing recombinantsPlasmi

5、d minipreparation4 day between PCR amplification and sequencing-confirmed plasmid (at best!)11第11頁，共56頁?；贏BI3730 xl平臺的擴展應(yīng)用2. STR:STR/SSR: 是由長度為2-7個堿基的核苷酸序列重復(fù)構(gòu)成的多態(tài)性DNA標(biāo)記，由于重復(fù)單位的重復(fù)次數(shù)在個體間呈高度可變性，因此在同一個基因位點創(chuàng)造了多個不同的等位基因。微衛(wèi)星分析通常被用來創(chuàng)建遺傳圖譜，連鎖分析以及對遺傳性狀的追蹤。原理：在一端引物上標(biāo)記特定的熒光,通過PCR產(chǎn)物長度大小，檢測基因型.12第12頁，共56頁。基于ABI3

6、730 xl平臺的擴展應(yīng)用2. STR:13第13頁，共56頁?；贏BI3730 xl平臺的擴展應(yīng)用3. SNP:傳統(tǒng)測序法金標(biāo)準(zhǔn)14第14頁，共56頁?；贏BI3730 xl平臺的擴展應(yīng)用3. SNP:傳統(tǒng)測序法金標(biāo)準(zhǔn)15第15頁，共56頁?；贏BI3730 xl平臺的擴展應(yīng)用3. SNP:SNaPshot適合5-12個及以上的SNP位點的檢測該檢測方法的主要原理為單堿基延伸技術(shù)，并且利用引物片段的大小，從而把不同位點的檢測結(jié)果區(qū)分開。 16第16頁，共56頁。基于ABI3730 xl平臺的擴展應(yīng)用17第17頁，共56頁。基于ABI3730 xl平臺的擴展應(yīng)用18第18頁，共56頁?；?/p>

7、于ABI3730 xl平臺的擴展應(yīng)用19第19頁，共56頁?；贏BI3730 xl平臺的擴展應(yīng)用3. SNP:SNPlexSNPlex Genotyping System是基于熒光檢測方法來進行。 DNA模板直接與一套3個探針組成的系統(tǒng)結(jié)合，這3個探針包括2個等位基因探針ASO和1個位點特異探針LSO。當(dāng)ASO探針和LSO探針與模板完全匹配時，連接酶連接兩條探針。然后使用生物素標(biāo)記的PCR引物擴增該連接產(chǎn)物。生物素標(biāo)記的擴增產(chǎn)物結(jié)合在鏈霉親核素包被的雜交板孔中，通過堿變性的方法使生物素標(biāo)記的單鏈PCR產(chǎn)物保留在雜交板中，然后該單鏈PCR產(chǎn)物與一套通用Zipchute探針雜交結(jié)合。這些探針帶有

8、熒光標(biāo)記，它們具有特殊的片段與單鏈PCR 產(chǎn)物的特殊部位互補，還包含有修飾部分，一條Zipchute 探針對應(yīng)一個待檢測等位基因，然后將雜交捕獲到的Zipchute 探針分離出來，通過毛細(xì)管電泳進行檢測，最后通過GeneMapper軟件分析來確定SNP基因型。20第20頁，共56頁?；贏BI3730 xl平臺的擴展應(yīng)用21第21頁，共56頁。第二代測序平臺454 (GS-FLX)SolexaSOLiD22第22頁，共56頁。454 (GS-FLX)原理： 依賴于核苷酸摻入中焦磷酸鹽的釋放。該技術(shù)是由波爾尼倫和穆斯塔法羅納吉于2019年在斯德哥爾摩的皇家工學(xué)院發(fā)展出來的。454的突破之處： 將

9、試劑和模板統(tǒng)統(tǒng)都吸附在一個個微珠上，然后把這些微珠一個個地放到芯片上的小孔中，每孔一個微珠。保證了反應(yīng)的獨立性，節(jié)省試劑耗材。23第23頁，共56頁。GS FLX系統(tǒng)的流程概括起來，就是“一個片段 = 一個磁珠 = 一條讀長（One fragment = One bead = One read）”。1）樣品輸入并片段化：GS FLX系統(tǒng)支持各種不同來源的樣品，包括基因組DNA、PCR產(chǎn)物、BAC、cDNA、小分子RNA等等。大的樣品例如基因組DNA或者BAC等被打斷成300800 bp的片段；對于小分子的非編碼RNA或者PCR擴增產(chǎn)物，這一步則不需要。短的PCR產(chǎn)物則可以直接跳到步驟3)。24

10、第24頁，共56頁。2）文庫制備：借助一系列標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，將A和B接頭（3和5端具有特異性）連接到DNA片段上。接頭也將用于后續(xù)的純化，擴增和測序步驟。具有A、B接頭的單鏈DNA片段組成了樣品文庫。3）一個DNA片段一個磁珠：單鏈DNA文庫被固定在特別設(shè)計的DNA捕獲磁珠上。每一個磁珠攜帶了一個獨特的單鏈DNA片段。磁珠結(jié)合的文庫被擴增試劑乳化，形成油包水的混合物，這樣就形成了只包含一個磁珠和一個獨特片段的微反應(yīng)器。25第25頁，共56頁。4）乳液PCR擴增：每個獨特的片段在自己的微反應(yīng)器里進行獨立的擴增，而沒有其他的競爭性或者污染性序列的影響。整個片段文庫的擴增平行進行。對于每一個片

11、段而言，擴增后產(chǎn)生了幾百萬個相同的拷貝。隨后，乳液混合物被打破，擴增的片段仍然結(jié)合在磁珠上。26第26頁，共56頁。攜帶DNA的捕獲磁珠放入PTP板中將PTP板放置在GS FLX中四種堿基依次循環(huán)進入PTP板發(fā)生堿基配對，釋放一個焦磷酸釋放出光信號（從螢光素到氧化螢光素）CCD捕獲一個磁珠一條讀長27第27頁，共56頁。454 (GS-FLX)小結(jié)：GS FLX系統(tǒng)的流程概括起來，就是“一個片段 = 一個磁珠 = 一條讀長（One fragment = One bead = One read）”。GS FLX系統(tǒng)在10小時的運行當(dāng)中可獲得100多萬個讀長，讀取超過4-6億個堿基信息。GS FL

12、X系統(tǒng)的準(zhǔn)確率在99%以上。其主要限制來自同聚物，也就是相同堿基的連續(xù)摻入，如AAA或GGG。454測序平臺的主要錯誤類型是插入-缺失，而不是替換。28第28頁，共56頁。Illumina公司的新一代測序儀Genome Analyzer最早由Solexa公司研發(fā)，利用其專利核心技術(shù)“DNA簇”和“可逆性末端終結(jié)（reversible terminator）”，實現(xiàn)自動化樣本制備及基因組數(shù)百萬個堿基大規(guī)模平行測序。Illumina 測序儀29第29頁，共56頁。Genome Analyzer技術(shù)的基本原理1. 文庫制備將基因組DNA打成幾百個堿基（或更短）的小片段，在片段的兩個末端加上接頭(ad

13、apter)。30第30頁，共56頁。Genome Analyzer技術(shù)的基本原理2. 產(chǎn)生DNA簇利用專利的芯片，其表面連接有一層單鏈引物，DNA片段變成單鏈后通過與芯片表面的引物堿基互補被一端“固定”在芯片上。另外一端（5或3）隨機和附近的另外一個引物互補，也被“固定”住，形成“橋 (bridge) “。反復(fù)30輪擴增，每個單分子得到了1000倍擴增，成為單克隆DNA簇。DNA簇產(chǎn)生之后，擴增子被線性化，測序引物隨后雜交在目標(biāo)區(qū)域一側(cè)的通用序列上。31第31頁，共56頁。Genome Analyzer技術(shù)的基本原理Genome Analyzer系統(tǒng)應(yīng)用了邊合成邊測序（Sequencing

14、By Synthesis）的原理。然后利用帶熒光基團的四種特殊脫氧核糖核苷酸，通過可逆性終止的SBS（邊合成邊測序）技術(shù)對待測的模板DNA進行測序。加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP。 這些核苷酸是“可逆終止子”，因為3羥基末端帶有可化學(xué)切割的部分，它只容許每個循環(huán)摻入單個堿基。此時，用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類。之后，將這些基團化學(xué)切割，恢復(fù)3端粘性，繼續(xù)聚合第二個核苷酸。如此繼續(xù)下去，直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。32第32頁，共56頁。Genome Analyzer系統(tǒng)的優(yōu)勢1. 可擴展的超高通量 Genome Analy

15、zer系統(tǒng)目前每次運行后可獲得超過20 GB的高品質(zhì)過濾數(shù)據(jù)。2. 需要樣品量少需要的樣品量低至100ng，能應(yīng)用在很多樣品有限的實驗（比如免疫沉淀、顯微切割等）中。3. 簡單、快速、自動化提供了最簡單和簡潔的工作流程。33第33頁，共56頁。SOLiD (Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection)原理 ：用連接法測序獲得基于“雙堿基編碼原理”的SOLiD顏色編碼序列，隨后的數(shù)據(jù)分析比較原始顏色序列與轉(zhuǎn)換成顏色編碼的reference序列，把SOLiD顏色序列定位到reference上，同時校正測序錯誤，并可結(jié)合原始顏色序列的質(zhì)量

16、信息發(fā)現(xiàn)潛在SNP位點。 SOLID 測序儀34第34頁，共56頁。SOLID工作流程A文庫制備B乳液PCR/微珠富集C微珠沉積D連接測序E數(shù)據(jù)分析35第35頁，共56頁。SOLID工作流程ACGTACGT2nd Base1st BaseDetecting a single color does not indicate a base Each reading contains information from two basesTo decode the bases you must know one of the bases in the sequence36第36頁，共56頁。SOLiD

17、 4-color ligation reaction37第37頁，共56頁。SOLiD 4-color ligation reactionTemplate Sequence 53 Adapter Oligo Sequence 1mbead1mbeadligaseligase3 p5 universal seq primer universal seq primer 53GT-probe53CT-probe53TT-probe5AT-proben n n A T z z zn n n GT z z zn n n T T z z zn n n C T z z zATp538第38頁，共56頁。SO

18、LiD 4-color ligation reaction39第39頁，共56頁。SOLiD 4-color ligation reaction40第40頁，共56頁。SOLiD 4-color ligation reactionACGTACGT2nd Base1st BaseIf know first base is an A then immediately it decodes 2nd base. This must be an A as Blue translates 2nd base A if first base AAACCGGTTACCAGTTGACCAGTTGAACCGGTTA

19、ACCGGTTAGCTGATCAGCTGATCAGCTGATCATCGGCTAExample :41第41頁，共56頁。SOLiD 4-color ligation reaction42第42頁，共56頁。優(yōu)勢：系統(tǒng)可擴展性最大的靈活性全基因表達圖譜分析更多RNA研究SNP分析甲基化分析SOLID 測序儀43第43頁，共56頁。第三代測序技術(shù)HeliScopePacific Biosciences：SMRT Oxford Nanopore Technologies44第44頁，共56頁。HeliScopeHelicos公司：基于單分子邊合成邊測序的原理隨機打斷成小片段3末端加上Poly(A)在

20、接頭末端加上CY3熒光標(biāo)記小片段與表面帶有寡聚Poly(T)的平板雜交加入DNA聚合酶和CY5熒光標(biāo)記的dNTP進行DNA合成反應(yīng)每一輪反應(yīng)加一種dNTP。洗脫，記錄熒光信號用化學(xué)試劑去掉熒光標(biāo)記，進行下一輪反應(yīng)。不斷地重復(fù)合成、洗脫、成像、淬滅過程完成測序45第45頁，共56頁。HeliScope基于單分子邊合成邊測序的原理46 Heliscope的讀取長度約為30-35 nt，每個循環(huán)的數(shù)據(jù)產(chǎn)出量為21-28 Gb。第46頁，共56頁。PacBio-SMRT基于邊合成邊測序的思想，以SMRT芯片為測序載體進行測序反應(yīng)。SMRT芯片是一種帶有很多ZMW(zero-mode waveguide

21、s，零模波導(dǎo))孔的厚度為100 nm的金屬片。將DNA聚合酶、待測序列和不同熒光標(biāo)記的dNTP放入ZMW孔的底部，進行合成反應(yīng)。與其他技術(shù)不同的是，熒光標(biāo)記的位置是3磷酸基團而不是5甲基堿基。47第47頁，共56頁。PacBio-SMRT48第48頁，共56頁。PacBio-SMRT當(dāng)一個dNTP被添加到合成鏈上的同時，它會進入ZMW孔的熒光信號檢測區(qū)并在激光束的激發(fā)下發(fā)出熒光，根據(jù)熒光的種類就可以判定dNTP的種類。其它未參與合成的dNTP由于沒進入熒光型號檢測區(qū)而不會發(fā)出熒光。在下一個dNTP被添加到合成鏈之前，這個dNTP的磷酸基團會被氟聚合物（fluoropolymer）切割并釋放，熒光分子離開熒光信號檢測區(qū)。49第49頁，共56頁。PacBio-SMRT合成過程中，每次進入一個堿基，原始數(shù)據(jù)會實時地產(chǎn)生一個脈沖峰，每兩個相鄰的脈沖峰之間有一定的距離。距離與模板上堿基是否存在修飾有關(guān)，如果有堿基修飾，就會導(dǎo)致兩個相鄰峰之間距離加大。根據(jù)這個距離的變化，可以判斷模板相應(yīng)位點是否出現(xiàn)堿基修飾，并且結(jié)果是實時的?？梢杂糜诩谆葔A基修飾研究。 50