食品微生物檢驗技術(shù)2012

1、食品微生物檢驗技術(shù)2011年2月發(fā)布人：吳兆華入門篇SHF QA&QC課程目錄一.認識微生物二.消毒與滅菌三.微生物實驗室四.食品微生物檢驗技術(shù)五.相關(guān)標(biāo)準一 ：認識微生物食物、食品、食品工業(yè)食物是人體生長發(fā)育、細胞更新、調(diào)節(jié)機能必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，也是產(chǎn)生熱量保持體溫、體力的能量來源。食品經(jīng)過加工制作的食物統(tǒng)稱為食品食品工業(yè)包括農(nóng)業(yè)、食品制造、市場三個方面，廣義上講，食品工業(yè)是國民經(jīng)濟的基礎(chǔ)和支柱之一。是一個永不衰弱的行業(yè)。微生物從不知到知的過程釀酒、天花，列文虎克、巴斯德、 科赫 遠古人類發(fā)現(xiàn)，吃剩的米粥數(shù)日后變成了醇香可口的飲料人類最早發(fā)明的酒天花是感染痘病毒引起的，無藥可治，每4名天花

2、病人當(dāng)中便有一人死亡，而剩余的3人卻要留下丑陋的痘痕。 明代以后，人痘接種法盛行起來。到目前為止，天花是在在世界范圍被人類消滅或控制的第一個傳染病。天花病毒安東列文虎克 荷蘭格拉夫 霍霍夫利特微生物的鼻祖 無孔不入的微生物，何時何地不在與人們打交道。甚至在我們體內(nèi)到處安營扎寨，自由出入。可是，人們不肉眼看見它們，因而幾千年來，人類竟不知道世界上還有微生物這東西存在。 直到1673年列文虎克用自制顯微鏡發(fā)現(xiàn)了“小動物”的微生物世界！他一生當(dāng)中磨制500多個鏡片，制造400多種顯微鏡，其中只有9種至今仍有人使用。雖然他活著的時候就看到人們承認了他的發(fā)現(xiàn)，但要等到100多年以后，當(dāng)人們在用效率更高的

3、顯微鏡重新觀察列文虎克描述的 “小動物”，并知道他們會引起人類嚴重疾病和產(chǎn)生許多有用物質(zhì)時，才真正認識到列文虎克對人類認識世界所作出的偉大貢獻。法國科學(xué)家路易斯巴斯德(1822-1895)被后人譽為“微生物學(xué)之父”。證實發(fā)酵由微生物引起免疫學(xué)預(yù)防接種鵝頸燒瓶實驗也創(chuàng)造了一種有效的滅菌方法巴氏滅菌法。 反駁微生物自然發(fā)生說鵝頸燒瓶實驗科學(xué)雖沒有國界，但科學(xué)家卻有自己的祖國德國的波恩大學(xué) 普法戰(zhàn)爭爆發(fā) 傳染病是人類健康的大敵。從古至今，鼠疫、傷寒、霍亂、肺結(jié)核等許多可怕的病魔奪去了人類無數(shù)的生命。人類要戰(zhàn)勝這些疾病，首先要弄清楚致病的原因。而第一個發(fā)現(xiàn)傳染病是由病原細菌感染造成的人就是羅伯特科赫。

4、 羅伯特科赫（18431910）-德國醫(yī)學(xué)家羅伯特.科赫發(fā)現(xiàn)結(jié)核桿菌一百周年 被后人尊為細菌學(xué)鼻祖，傳染病的克星，細菌學(xué)的奠基人和開拓者2003年，經(jīng)過全球10個國家的科學(xué)家的共同努力，終于確認了冠狀病毒是SARS的病原體。最終判定這種冠狀病毒是否真正的元兇，依靠的是100多年前德國偉大的細菌學(xué)家科赫提出的“科赫原則”。1870結(jié)婚-1873年30歲生日-1910腐敗-食品因變質(zhì)而產(chǎn)生臭氣、刺激味和毒性物質(zhì)的現(xiàn)象。變質(zhì)凡引起食品理化性質(zhì)發(fā)生改變的現(xiàn)象。防腐-防止或阻止微生物生長繁殖的方法。防腐劑-能殺死微生物或抑制微生物生長的化學(xué)物質(zhì)消毒劑-用于殺滅傳播媒介上的微生物使其達消毒或滅菌要求的制劑

5、。 滅菌劑 -可殺滅一切微生物(包括細菌芽孢)使其達到滅菌要求的制劑。無菌-不含有活的微生物的意思。商業(yè)無菌-殺滅在正常的商品管理條件下的貯運銷售期間有礙人類健康的細菌。無菌技術(shù)（無菌操作）：防止微生物進入機體或物體的方法。術(shù)語概論 微生物概念：微生物是一個通稱， 形體微小，結(jié)構(gòu)簡單的低等生物。 微生物類別：包括細菌、霉菌、酵母菌、支原體、衣原體、立克次氏體、微藻及原生動物類等。 細菌 單細胞原核生物：光學(xué)顯微鏡（油鏡）下放大一千倍以上并染色才能清楚看見其個體。如人體腸道內(nèi)的大腸桿菌、糞鏈球菌，用于釀醋的醋酸桿菌，使牛奶變酸的乳酸桿菌，生產(chǎn)味精的谷氨酸短桿菌，生產(chǎn)淀粉酶的枯草桿菌等。 細胞壁主

6、要成分是肽聚糖，功能包括：保持細胞外形；抑制機械和滲透損傷；介導(dǎo)細胞間相互作用；防止大分子入侵；協(xié)助細胞運動和分裂。細胞膜主要成分是磷脂，蛋白質(zhì)糖脂組成。功能包括：使細胞維持穩(wěn)定代謝的胞內(nèi)環(huán)境，調(diào)節(jié)和選擇物質(zhì)進出細胞。細胞質(zhì)主要成分是可溶性酶、糖、無機鹽和水等。功能包括：進行新陳代謝的主要場所，絕大多數(shù)的化學(xué)反應(yīng)都在細胞質(zhì)中進行。同時它對細胞核也有調(diào)控作用。 細胞核含有DNA是細胞的控制中心，在細胞的代謝、生長、分化中起著重要作用。功能：控制細胞的遺傳，生長和發(fā)育。莢膜是某些細菌在細胞壁外包圍的一層粘液性物質(zhì)，一般由糖和多肽組成。功能：抗吞噬作用粘附作用抗有害物質(zhì)的損傷作用抗干燥作用等鞭毛在某

7、些細菌菌體上具有細長而彎曲的絲狀物，是細菌的運動器官。霉菌 真核生物，單細胞或多細胞絲狀真菌可用低倍或高倍鏡觀察其形態(tài)。如釀制小曲酒的根霉、制豆腐乳的毛霉、生產(chǎn)葡萄糖的曲霉菌、生產(chǎn)青霉素的青霉等。 。酵母菌 單細胞真菌，最低等的真核生物。一般用高倍鏡（401600倍）觀察其個體細胞形態(tài)。如面包酵母、釀酒酵母、紅酵母等。 支原體、衣原體、立克次氏體 單細胞，介于細菌與病毒之間的一類原始而小型的原核微生物。 衣原體模型微細藻類單細胞藻類：如紅藻、綠藻、小球藻等。 原生動物 單細胞，無真正細胞壁。如變形蟲、吸管蟲、草履蟲等。 種類多-到目前為止，人們已認識的微生物已有10多萬種。 分布廣-微生物因其

8、形體微小，重量輕，故可以隨著風(fēng)和水流到處傳播。 繁殖快-微生物驚人的生長繁殖速度是其他任何生物都望塵莫及的。一般細菌的世代時間為幾十分鐘到一百多分鐘。在最適宜的條件下，人們最熟悉的大腸桿菌每1320min就可分裂出新的一代。 代謝強-微生物的代謝強度比起高等生物要高出幾百到幾萬倍，主要表現(xiàn)在吸收多轉(zhuǎn)化快。 易變異-微生物結(jié)構(gòu)簡單,因而在受到外界物理或化學(xué)因素影響后，很容易引起細胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)發(fā)生突變，結(jié)果導(dǎo)致變異。另一個原因是細胞增殖速度快。微生物的特性來自土壤 水 空氣 人體食品中微生物來源來自-土壤 土壤是微生物的天然培養(yǎng)基，它具備微生物正常發(fā)育所必須的一切條件。含有大量的微生物，細菌來自

9、天然生活在土壤中的自養(yǎng)菌和腐物寄生菌以及隨動物排泄物及其尸體進入土壤的細菌。來自-水 水也是微生物存在的天然環(huán)境，水中的細菌來自土壤、塵埃、污水、人畜排泄物及垃圾等。來自-空氣 在冬春季節(jié)，更容易發(fā)生感冒等傳染病，就是因為空氣的傳播。來自-人體 人自出生后，外界的微生物就逐漸進入人體。在正常人體皮膚、粘膜及外界相通的各種通道（如口腔、鼻咽腔、腸道和泌尿道）等部位，都存在著微生物群。微生物引起食品腐敗變質(zhì) 食品中含有蛋白質(zhì)，脂肪，碳水化合物，這些成份是微生物的生長基質(zhì)，所以微生物在食品中能夠生長繁殖。環(huán)境中無處不存在微生物，食物在生產(chǎn)、加工、運輸、儲存、銷售過程中，很容易被微生物污染。只要溫度適

10、宜，微生物就會生長繁殖，分解食物中的營養(yǎng)素。這時食物中的蛋白質(zhì)就被破壞了，食物會發(fā)出臭味和酸味，顏色也會發(fā)生變化從而造成食品變質(zhì)。乳及乳制品的營養(yǎng)成分比較完全，都含有豐富的蛋白質(zhì)、極易吸收的鈣等。因此極易為微生物所腐敗變質(zhì)。二：消毒和滅菌概念消毒 -殺滅或清除傳播媒介上病原微生物,使其達到無害化的FF。滅菌 -用物理和化學(xué)方法殺滅或清除傳播媒介上一切微生物的方法。溫度 利用溫度進行滅菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。高溫可使微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和酶類發(fā)生變性而失活，從而起滅菌作用.低溫通常起抑菌作用。 嗜冷微生物適合于10生活的細菌，最適生長溫度在20左右。 嗜溫微生物生長溫度在15

11、45之間，最適生長溫度在37左右的細菌。 嗜熱微生物生長溫度在3075之間，最適生長溫度在55，在100以上溫度生長，稱為嗜高熱微生物。消毒與滅菌方法 一、干熱滅菌法 1.火焰滅菌（酒精燈） 2.干熱滅菌（電熱干燥箱） 二、濕熱滅菌法 1.巴氏消毒 2.煮沸消毒 3.間歇滅菌法 4.加熱蒸汽滅菌法（高壓滅菌鍋） 三、輻射 四、過濾 五、化學(xué)方法干熱滅菌法a.灼燒滅菌法：利用火焰直接把微生物燒死。此法徹底可靠，滅菌迅速，但易焚毀物品，所以使用范圍有限，只適合于接種針、環(huán)、試管口及不能用的污染物品或?qū)嶒瀯游锏氖w等的滅菌。b.干熱空氣滅菌法：這是實驗室中常用的一種方法，即把待滅菌的物品均勻地放入烘

12、箱中，升溫至160C，恒溫1小時即可。此法適用于玻璃皿、金屬用具等的滅菌。濕熱滅菌法在同樣的溫度下，濕熱滅菌的效果比干熱滅菌好a.巴氏消毒法：有些食物因高溫破壞營養(yǎng)成分，如牛奶、醬油、啤酒等，只能用較低的溫度來殺死其中的病原微生物，這樣既保持營養(yǎng)和風(fēng)味，又進行消毒。該法一般在62C，30分鐘既可達到消毒目的。b.煮沸消毒法：直接將要消毒的物品放入清水中，煮沸15分鐘，即可殺死細菌的全部營養(yǎng)和部分芽孢。c.間歇滅菌法：上述兩種方法在常壓下，只能起到消毒作用，而很難做到完全無菌。若采用間歇滅菌的方法，就能殺滅物品中所有的微生物。具體做法是：將物品加熱至100C，1530分鐘。然后冷卻，放入37恒溫

13、箱中過夜，讓殘留的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體。第2天再重復(fù)上述步驟，三次左右，就可達到滅菌的目的。 d. 加壓蒸汽滅菌法：在蒸汽壓達到1.055公斤時，加壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)的溫度可達到121C。在這種情況下，微生物（包括芽孢）在15-20分鐘便會被殺死，而達到滅菌目的。 輻射及過濾輻射：利用輻射進行滅菌消毒，可以避免高溫滅菌或化學(xué)藥劑消毒的缺點，所以應(yīng)用越來越廣，目前主要應(yīng)用在以下幾個方面：）接種室、手術(shù)室、食品、藥物包裝室常應(yīng)用紫外線殺菌。）應(yīng)用射線作食品表面殺菌，射線用于食品內(nèi)部殺菌。過濾：采用機械方法，設(shè)計一種濾孔比細菌還小的篩子，做成各種過濾器。通過過濾，從而達到除菌的目的。但是比細菌還小的病毒仍然

14、能留在液體培養(yǎng)基內(nèi)。超高溫殺菌： 135-150C和2-8s對液態(tài)食品進行?？杀３质称穬r值和營養(yǎng)成分?；瘜W(xué)方法一般化學(xué)藥劑無法殺死所有的微生物，而只能殺死其中的病原微生物，所以是起消毒劑的作用，而不是滅菌劑。一種化學(xué)藥物是殺菌還是抑菌，常不易嚴格區(qū)分。消毒劑在低濃度時也能殺菌。由于消毒防腐劑不僅能殺死或抑制病原微生物，而且對人體組織細胞也有損傷作用，所以只能用于體表、器械、排泄物和環(huán)境的消毒。常用的化學(xué)消毒劑有：石碳酸、來蘇水（甲醛溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。 三：食品微生物實驗室生物實驗室級別管理制度建設(shè)布局常用儀器及用途生物安全水平分級生物安全防護水平（biosafety level，B

15、SL）分為4級，以表示實驗室的相應(yīng)生物安全防護水平。BSL1：防護水平最低,普通建筑物即可，每個實驗室應(yīng)設(shè)洗手池。 BSL-2：實驗室的門有可視窗。在實驗室工作區(qū)域外還應(yīng)當(dāng)有供長期使用的存儲空間。在實驗室內(nèi)使用專門的工作服；應(yīng)戴乳膠手套。配備高壓蒸汽滅菌器，在實驗室內(nèi)配備生物安全柜。BSL-2生物安全水平分級BSL3實驗室：自成隔離區(qū)（有出入控制）或為獨立建筑物。 BSL4 防護水平最高。實驗室應(yīng)建造在獨立的建筑物內(nèi)或建筑物中獨立的完全隔離區(qū)域內(nèi)，該建筑物應(yīng)遠離城區(qū)。 實驗室管理制度 1實驗室應(yīng)制定儀器配備管理使用制度，藥品管理使用制度，玻璃器皿管理使用制度，并根據(jù)安全制度和環(huán)境條件的要求，本

16、室工作人員應(yīng)嚴格掌握，認真執(zhí)行。2進入實驗室必須穿工作服，進入無菌室換無菌衣、帽、鞋，戴好口罩，非實驗室人員不得進入實驗室，嚴格執(zhí)行安全操作規(guī)程。3實驗室內(nèi)物品擺放整齊，試劑定期檢查并有明晰標(biāo)簽，儀器定期檢查、保養(yǎng)、檢修, 嚴禁在冰箱內(nèi)存放和加工私人食品。4各種器材應(yīng)建立請領(lǐng)消耗記錄，貴重儀器有使用記錄，破損遺失應(yīng)填寫報告；藥品、器材、菌種不經(jīng)批準不得擅自外借和轉(zhuǎn)讓，更不得私自拿出。5禁止在實驗室內(nèi)吸煙、進餐、會客、喧嘩，實驗室內(nèi)不得帶入私人物品，離開實驗室前認真檢查水、電、暖氣、門窗，對于有毒、有害、易燃、污染、腐蝕的物品和廢棄物品應(yīng)按有關(guān)要求執(zhí)行。檢驗室建設(shè)布局圖 1.辦公臺 2.文件柜

17、3.樣品柜 4.通風(fēng)櫥 5.實驗邊臺 6，7.無菌臺 8.天平臺9.在落地儀器區(qū)再加個高溫儀器臺，放高壓滅菌鍋、干燥箱、水浴鍋、電熱板等無菌室建設(shè) 檢驗環(huán)境要求 微生物學(xué)檢驗室要求操作區(qū)域與辦公區(qū)域分開。洗滌室、培養(yǎng)室、消毒間、無菌室應(yīng)分開。無菌室要設(shè)有套間或緩沖間，最好設(shè)推拉門，以防空氣振蕩過大。微生物檢驗室應(yīng)備有自動或腳踩式洗手池和固定的消毒設(shè)施。 食品微生物實驗室 常用儀器及用途潔凈工作臺（超凈工作臺、無菌臺）是一種供人操作的通用型局部凈化設(shè)備，通過風(fēng)機將空氣吸入，經(jīng)由靜壓箱通過高效過濾器過濾，將過濾后的潔凈空氣以垂直或水平氣流的狀態(tài)送出，使操作區(qū)域持續(xù)在潔凈空氣的控制下達到百級潔凈度它

18、可造就局部高清潔度空氣環(huán)境。生物安全柜是為操作原代培養(yǎng)物、菌毒株以及診斷性標(biāo)本等具有感染性的實驗材料時，用來保護操作者本人、實驗室環(huán)境以及實驗材料，使其避免暴露于上述操作過程中可能產(chǎn)生的感染性氣溶膠和濺出物而設(shè)計的。高壓滅菌鍋烘箱培養(yǎng)箱水浴鍋顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡顯微鏡被用來放大微小物體的圖像。一般應(yīng)用于對生物、醫(yī)藥、微觀粒子等觀測。分光光度計分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量pH計離心機PCR儀原理：采用實時熒光PCR技術(shù)檢測食品中是否有致病菌；靈敏度：對目標(biāo)菌檢測靈敏度為1個/g效率：檢測過程用時2-4H主要耗材：各菌種試劑盒真空泵冰箱純

19、水機振蕩器/均質(zhì)機移液器其它儀器四：食品微生物檢驗技術(shù)主要內(nèi)容1.微生物檢測作業(yè)規(guī)范2.微生物檢驗流程3.常見衛(wèi)生指標(biāo)及致病菌4.測定微生物的大小5.測定微生物的數(shù)量6.菌落總數(shù)的測定7.大腸菌群的測定8.生產(chǎn)環(huán)境檢測無菌操作基本技術(shù)用于防止微生物進入人體組織或其它無菌范圍的操作技術(shù)稱為無菌操作。如外科手術(shù)需防止細菌進入傷口及各種微生物實驗中,為了防止其它微生物影響實驗的進行,也要在無菌的環(huán)境下進行. 無菌操作的要求是: 1操作前將界面上的細菌和病毒等微生物殺滅 2操作過程中是界面與外界隔離,避免微生物的侵入 一、在執(zhí)行無菌操作時，必須明確物品的無菌區(qū)和非無菌區(qū)。 二、執(zhí)行無菌操作前，先戴帽子

20、、口罩、洗手，并將手擦干，注意空氣和環(huán)境清潔。 三、夾取無菌物品，必須使用無菌持物鉗。 四、進行無菌操作時，凡未經(jīng)消毒的手、臂、均不可直接接觸無菌物品或超過無菌區(qū)取物。 五、無菌物品必須保存在無菌包或滅菌容器內(nèi)，不可暴露在空氣中過久。無菌物與非無菌物應(yīng)分別放置。無菌包一經(jīng)打開即不能視為絕對無菌，應(yīng)盡早使用。凡已取出的無菌物品雖未使用也不可再放回?zé)o菌容器內(nèi)。 六、無菌包應(yīng)按消毒日期順序放置在固定的柜櫥內(nèi)，并保持清潔干燥，與非滅菌包分開放置，并經(jīng)常檢查無菌包或容器是否過期。七、在操作前2030分鐘要先啟動超凈臺和紫外燈，并認真洗手和消毒。在操作時，嚴禁喧嘩，嚴禁用手直接拿無菌物品，如瓶塞等，而必須

21、用消毒的鉗、鑷子等。傾倒平板應(yīng)在超凈臺內(nèi)操作，并且在開啟和加蓋瓶塞時需反復(fù)用酒精燈燒。對于吸管應(yīng)先用手拿后1/3處，并用酒精燈燒烤之后再吸液體。無菌操作原則1.微生物檢測作業(yè)規(guī)范 培養(yǎng)液配制完成后，殺菌前放入冰箱冷藏保存，但必須在48小時內(nèi)對其進行分裝殺菌使用。已殺菌未開封的培養(yǎng)液在24小時內(nèi)可直接使用；已殺菌未開封超過24小時或者已殺菌但開封而未用完的培養(yǎng)液都必須重新殺菌后使用。同一培養(yǎng)液反復(fù)殺菌不超過2次。進入無菌間作業(yè)時必須做到：緩沖間、無菌間的紫外燈開啟時間超過半小時；關(guān)閉紫外燈后，微檢員把作業(yè)過程中將用到的所有物品放在緩沖間，同時在緩沖間更換專用的工作衣，同時佩戴口罩和衛(wèi)生帽，然后再

22、將物品轉(zhuǎn)移到無菌間；作業(yè)時關(guān)閉紫外燈、空調(diào)、和無菌操作臺風(fēng)機；完成作業(yè)后，立即做好相關(guān)標(biāo)識、填寫實驗記錄，然后清理無菌間。清理結(jié)束后，開啟紫外燈殺菌30分鐘。無菌間只允許放置無菌操作臺、轉(zhuǎn)椅、水浴鍋；無菌操作臺上只允許擺放以下物品： 物 品數(shù) 量物 品數(shù) 量酒精燈1個滅菌平皿10塊打火機1個試管架2副接種針1個滅菌吸管根據(jù)需要消毒棉球1瓶電子稱1臺洗耳球1個250ml滅菌三角瓶2個鑷子1個培養(yǎng)基根據(jù)需要油性筆1支混勻器1臺 樣品的采集1 所用接觸樣品的用具經(jīng)過滅菌（不能用消毒劑消毒）2 取樣要均勻、特殊樣品要控制溫度 3 樣品采好后要貼上標(biāo)簽（注明：樣品名稱、來源、數(shù)量、采樣人、地點及時間）一

23、般可保存在0-5的環(huán)境中，如果樣品是冷凍食品，應(yīng)保持在冷凍狀態(tài)，并及時送檢。4 采好的樣品送檢不要超過3小時2.微生物檢測流程3.常見衛(wèi)生指標(biāo)及致病菌細菌總數(shù)大腸菌群霉菌和酵母菌大腸桿菌（肉制品）沙門氏菌（禽、畜肉）副溶血性弧菌（水產(chǎn)品）金黃色葡萄球菌（剩飯）單增李斯特氏菌（乳制品、冷藏食品）肉毒梭菌（發(fā)酵制品、肉制品）4.測定微生物的大小測量方法：測微尺長度單位：微米表示方法：球菌：直徑 桿菌：長*寬 螺菌：長、寬5.測定微生物數(shù)量方法：活菌計數(shù)法平板菌落計數(shù)法；總菌計數(shù)法血球計數(shù)板或霍瑟（Peroff Hausser）細菌計數(shù)板（二者原理和部件相同，只是厚薄不同而已）。 6.菌落總數(shù)的測定

24、菌落的定義：將細菌接種在固體培養(yǎng)基上經(jīng)1824小時培養(yǎng)，長出肉眼可見的來源于一個細胞的細菌集團。菌落總數(shù)：食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得1ml（g）檢樣中所含菌落的總數(shù)。檢測意義：菌落總數(shù)常作為評價食品被污染程度的一個重要指標(biāo)。預(yù)測保質(zhì)期。菌落總數(shù)的檢驗程序25g(ml)樣品+225ml生理鹽水（0.85%）(1:10的稀釋液)作幾個適當(dāng)倍數(shù)的稀釋液(例如1:100，1:1000)選擇23個適宜稀釋度各取1ml分別加入滅菌培養(yǎng)皿中平皿中加1520ml 營養(yǎng)瓊脂（46），于361培養(yǎng)48h 菌落記數(shù)/報告GB 4789.2-2010 （1）以無菌操作，將檢樣25g（或25mL）剪碎以

25、后，放于含有225mL滅菌生理鹽水三角瓶內(nèi)，經(jīng)充分振搖做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質(zhì)器中以8000r/min-100000r/min的速度處理1min，做成1：10的均勻稀釋液。 （2）用1mL滅菌吸管吸取1：10稀釋液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL滅菌生理鹽水的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)稀釋液，下同），振搖試管混合均勻，做成1：100的稀釋液。 （3）另取1mL的滅菌吸管，按上項操作順序作10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次，即換用1支1mL滅菌吸管。 檢樣稀釋及培養(yǎng)1 （4）對檢樣污染情況的估計，選擇2-3個適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時

26、，即以吸取該稀釋度的吸管移1mL稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度作兩個平皿。 （5）稀釋液移入平皿后，應(yīng)及時將涼至46 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入平皿15mL-20mL，并轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻，同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1mL生理鹽水的滅菌平皿內(nèi)作空白對照。 （6）等瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置（361）恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)（482）h取出，計算平板內(nèi)菌落數(shù)目乘以倍數(shù)，即得1g（1mL）樣品所含菌落總數(shù)。 檢樣稀釋及培養(yǎng)2樣品稀釋程序流程圖菌落計算方法可用肉眼觀查，必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計數(shù)以菌落形成單位（CFU)表示.平板菌落數(shù)的選擇 選取菌落數(shù)在30300之間,無蔓延菌落

27、生長的平板作為菌落總數(shù)。300的記錄多不可計；每個稀釋度應(yīng)采用兩個平板平均數(shù)； 其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)，若片狀菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘2以代表全皿菌落數(shù)； 平皿內(nèi)如有菌落之間無明顯界線，可視為一個菌落數(shù)；報告菌落總數(shù)計算方法 若只有一個稀釋度菌落在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，計算平均值X 稀釋倍數(shù)；作為結(jié)果； 若兩個連續(xù)稀釋度的菌落都在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時按公式計算： 報告 若所有稀釋度平均菌落數(shù)均300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均300或30

28、時，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。報告菌落數(shù)的報告 菌落數(shù)100內(nèi)時，按四舍五入修約，以整數(shù)報告，100時，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，第三位數(shù)以四舍五入方法修約；取前兩位數(shù)字，后面用0代替，也可用10的指數(shù)表示； 若平板上為蔓延菌落無法計數(shù)，則報告菌落蔓延； 若空白上長菌，則實驗失?。?稱重以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/ml為單位報告。報告 菌落總數(shù)檢測注意事項：1 操作要在無菌的狀態(tài)下進行。2 操作時間越短越好。3 樣品不同選擇的稀釋倍數(shù)不同。4 培養(yǎng)基冷卻溫度不宜過高或過低。7.大腸菌群的測定大腸菌群的定義：系指一群在3724小時能發(fā)酵

29、乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，以此作為糞便污染指標(biāo)來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量。檢測意義：該菌主要來源于人畜糞便，故該指標(biāo)體現(xiàn)了食品被糞便污染的程度。7.大腸菌群的測定 基本概念大腸菌群包括大腸埃希氏菌（大腸桿菌）、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。大腸菌群的來源分糞便來源和非糞便來源，在44.5仍能生長的大腸菌群，稱為糞大腸菌群，糞大腸菌群又叫耐熱大腸菌群，在人和動物糞便中所占的比例較大，而且在自然界容易死亡。因此，糞大腸菌群對糞便污染的指示作用更為直接和貼切，主要就是大腸桿菌，但也包括克雷伯氏菌屬，正是由于包括了克雷伯氏菌屬，使其與糞便污染

30、的相關(guān)性受到了影響。大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌這三個指標(biāo)在實際工作中都在應(yīng)用，但用途有所不同，一般認為大腸菌群是水源的衛(wèi)生指標(biāo)和食品加工衛(wèi)生狀況的通用指標(biāo)，糞大腸菌群主要用于貝類和貝類養(yǎng)殖用水的衛(wèi)生指標(biāo)，大腸桿菌用于指示食品受到近期糞便污染或不衛(wèi)生加工。大腸菌群表示方法：最可能數(shù)-MPN（ mostprobablenumber） /100mL 。 大腸菌群的測定流程檢樣25g（ml）+225ml稀釋液，均質(zhì)10倍系列，稀釋選擇適宜3個連續(xù)稀釋度的樣品勻液，接種LST肉湯管產(chǎn)氣不產(chǎn)氣BGLB肉湯產(chǎn)氣不產(chǎn)氣大腸菌群陰性大腸菌群陽性查MPN表報告結(jié)果361482h361482hGB 4789.3

31、-20101.LST:月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯2.BGLB：煌綠乳糖膽鹽肉湯大腸菌群的測定步驟檢驗稀釋 取樣及稀釋方法與菌落總數(shù)檢驗方法相同。初發(fā)酵試驗 根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)z樣污染程度的估計，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管LST,每管接種量為1ml。如接種量在1ml以上者,用雙料LST。置361溫箱內(nèi),培養(yǎng)242h,觀察倒管是否有氣泡產(chǎn)生，產(chǎn)氣者進行復(fù)發(fā)酵試驗，如未產(chǎn)氣者則繼續(xù)培養(yǎng)至48 2h，產(chǎn)氣者進行復(fù)發(fā)酵試驗。未產(chǎn)氣者報告大腸菌群陰性。復(fù)發(fā)酵試驗用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物一環(huán)，接種于BGLB管中， 361溫箱內(nèi),培養(yǎng)482h,觀察倒管是否有氣泡產(chǎn)生，產(chǎn)氣者記為大腸菌群陽性管。報告 根據(jù)證實為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查MPN表，報告每100ml（g）大腸菌群的MPN值。大腸菌群的測定 注意事項初發(fā)酵陽性管，只能經(jīng)過復(fù)發(fā)酵實驗后，才有可能成為陽性。在實際工作中，有時遇到初發(fā)酵時產(chǎn)酸，但導(dǎo)管內(nèi)無氣泡產(chǎn)生，復(fù)發(fā)酵卻證實為大腸菌群陽性。有時導(dǎo)管內(nèi)無氣體，但在液面及管壁卻可看到小氣泡。如何避免放小倒管時產(chǎn)生氣泡（大腸菌群檢測）？ 客戶要求大腸菌群ml(g),請問如何檢測和報告？LST發(fā)酵管和BGLB發(fā)酵管在滅菌以后要檢查小導(dǎo)管內(nèi)有無氣泡,如果有氣泡就不能再用了。計算產(chǎn)氣管的數(shù)量時以BGLB發(fā)酵管產(chǎn)氣管的數(shù)量為準。國標(biāo)另